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開發(fā)用紅光控制生命現(xiàn)象的技術(shù)~實現(xiàn)基因表達(dá)和DNA重組反應(yīng)的光操作~研究成果 刊登日期: 2022年6月14日 東京大學(xué) 神奈川縣立產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所 理化研究所 東京都立大學(xué) 科技振興機(jī)構(gòu)( JST ) 主講人 桑崎勇人(東京大學(xué)研究生院綜合文化研究科廣域科學(xué)專業(yè)研究生(研究當(dāng)時) ) 山本翔太(東京大學(xué)研究生院綜合文化研究科廣域科學(xué)專業(yè)特別研究員(研究當(dāng)時) ) 小田部堯廣(東京大學(xué)研究生院綜合文化研究科廣域科學(xué)專業(yè)特聘研究員(研究當(dāng)時) ) 中嶋隆浩(神奈川縣立產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所全職研究員) 清水義宏(理化研究所生命功能科學(xué)研究中心無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成研究小組組長) 成川禮(東京都立大學(xué)研究生院理學(xué)研究科生命科學(xué)專業(yè)副教授) 矢澤真幸(哥倫比亞大學(xué)康復(fù)再生醫(yī)療學(xué)科藥理學(xué)科副教授) 佐藤守俊(東京大學(xué)研究生院綜合文化研究科廣域科學(xué)專業(yè)教授) 發(fā)布要點 開發(fā)可以用紅光控制生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)技術(shù)。 具體實現(xiàn)紅光基因表達(dá)和DNA重組反應(yīng)的光操作。 期待著生物深部生物分子和基因向功能闡明的展開 發(fā)布概述 東京大學(xué)研究生院綜合文化研究科的桑崎勇人研究生(研究當(dāng)時)和佐藤守俊教授是該研究科的山本翔太研究員(研究當(dāng)時)、小田部堯廣研究員(研究當(dāng)時)、神奈川縣立產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所的中嶋隆浩研究員、以及理化學(xué)研究所生命功能科學(xué)研究中心的清水義宏團(tuán)隊組長、 通過與東京都立大學(xué)研究生院理學(xué)研究科的成川禮副教授、哥倫比亞大學(xué)康復(fù)再生醫(yī)療學(xué)科藥理學(xué)科的矢澤真幸副教授等的共同研究，成功開發(fā)出了可以用生物組織透過性極高的紅光操作生物深部生命現(xiàn)象的光開關(guān)蛋白質(zhì)( magred:magred )。 光開關(guān)蛋白是用光操作細(xì)胞內(nèi)和生物體內(nèi)各種生物分子功能的基礎(chǔ)技術(shù)工具。 雖然已經(jīng)報道了幾種基于紅光的光開關(guān)蛋白質(zhì)，但還存在哺乳類所沒有的需要添加色素的點、光控制能力明顯低的點、沒有通用性的點等重大課題。 本研究開發(fā)的MagRed不需要添加外源性色素，僅紅色光的onoff就具有極高的控制能力，同時憑借其通用性，實現(xiàn)了基因表達(dá)和DNA重組反應(yīng)的光操作。 這種新型紅光開關(guān)蛋白有望極大地拓展生命現(xiàn)象光操作的應(yīng)用潛力。 本研究成果刊登在英國科學(xué)雜志《Nature Biotechnology》(在線版: 6月13日(英國夏令時間) )上。 本研究成果是， 國立研究開發(fā)法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)( JST )的戰(zhàn)略性創(chuàng)造研究推進(jìn)事業(yè)( CREST )“利用光的特性開發(fā)和應(yīng)用生命功能的時空控制技術(shù)”(研究總結(jié):影山龍一郎理化學(xué)研究所腦神經(jīng)科學(xué)研究中心中心中心長)中的“基因組的光操作技術(shù)的開發(fā)和在生命現(xiàn)象闡明中的應(yīng)用”( JST ) 課題編號: JPMJCR1653 )、神奈川縣立產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所( KISTEC )的戰(zhàn)略性研究系列培養(yǎng)事業(yè)(研究代表:佐藤守俊)、日本學(xué)術(shù)振興會作為utec-u Tokyo FSI research grant program (研究代表:佐藤守俊)、日本學(xué)術(shù)振興會( JSPS )特別研究員DC2 (研究代表:桑崎勇人，課題編號: JP20J14492 )的一部分獲得。 發(fā)布詳細(xì)信息 研究背景 近年來，在生命現(xiàn)象和疾病中發(fā)揮重要作用的基因和生物分子可以用光自由操作的技術(shù)備受關(guān)注。 特別是，相當(dāng)于被稱為“生物體之窗(注1 )”的波長區(qū)域( 650~800 nm )的紅光難以被生物體組織吸收，容易到達(dá)生物體深部，因此期待開發(fā)基于紅光的光操作技術(shù)。 雖然已經(jīng)報道了一些現(xiàn)有技術(shù)，但都存在著由于沒有通用性和普遍性，與光照射無關(guān)地工作，所以光控制能力明顯低的課題，以及需要添加哺乳類所沒有的來自光合生物的色素等不便。 在這樣的背景下，迫切需要開發(fā)能夠克服現(xiàn)有技術(shù)問題的基于紅色光的光操作基礎(chǔ)技術(shù)。 研究內(nèi)容 本研究組在各種細(xì)菌所攜帶的紅光受體蛋白的細(xì)菌細(xì)胞色素( BphP ) (注2 )中，特別關(guān)注放射抗性細(xì)菌( Deinococcus radiodurans )所具有的BphP(DrBphP ) DrBphP以哺乳動物細(xì)胞內(nèi)在色素的膽綠素( BV，注3 )為輔因子結(jié)合，具有結(jié)構(gòu)響應(yīng)紅光(~ 660 nm )發(fā)生較大變化的性質(zhì)。 通過開發(fā)識別并結(jié)合該DrBphP結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)(以下稱為粘合劑)，認(rèn)為可以開發(fā)紅色光開關(guān)蛋白質(zhì)(圖1 )。 制作了抗體樣分子仿射體(注4 )的突變體庫，使用核糖體顯示法(注5 )，分離了僅在照射紅光的條件下與DrBphP結(jié)合的仿射體作為候選粘合劑。 通過對用該進(jìn)化分子工程學(xué)方法(注6 )得到的候選粘合劑進(jìn)行氨基酸變異和末端氨基酸的刪除等修飾，成功開發(fā)了改善了紅光照射時的結(jié)合效率的粘合劑。 這種由DrBphP和仿射體(粘合劑)組成的光開關(guān)蛋白，意為本研究小組以前開發(fā)的藍(lán)色光開關(guān)蛋白“Magnet”(磁鐵，注7 )的紅色版本，稱為“MagRed”(灰色)（図1）。
圖1 .本研究開發(fā)的紅光開關(guān)蛋白“MagRed”(巖漿)。 ( a ) MagRed由輻射抗性細(xì)菌( Deinococcus radiodurans )攜帶的紅光受體( DrBphP )及其結(jié)合蛋白(纖維體)組成。 DrBphP(Pr型，暗狀態(tài))吸收紅光(~ 660 nm )后結(jié)構(gòu)變化成為Pfr型(亮狀態(tài))，與仿射體結(jié)合。 在此，通過照射800 nm的光或在暗環(huán)境下放置，DrBphP恢復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)( Pr型、暗狀態(tài))，仿射體解離。 ( b )抗體樣分子仿射體的結(jié)構(gòu)。 構(gòu)成α螺旋表面的13個氨基酸是可變的，通過改變它們可以開發(fā)抗原特異性纖維體。 本研究利用進(jìn)化分子工程學(xué)的方法等，開發(fā)了與吸收紅光(~ 660 nm )的DrBphP特異性結(jié)合的仿射體。 然后研究了MagRed在基因表達(dá)光操作技術(shù)( CPTS ) (注8 )中的應(yīng)用(圖2 )。 CPTS是本研究小組以前利用藍(lán)光開關(guān)蛋白和CRISPR-Cas9系統(tǒng)(注9 )報道的基因表達(dá)的光操作技術(shù)。 將其他研究組報道的兩個紅光開關(guān)蛋白( RpBphP1-PpsR2、RpBphP1-QPAS1)應(yīng)用于CPTS，盡管均在暗環(huán)境下，但檢測到較高的基因表達(dá)活性(圖3 )。 由此可見，現(xiàn)有紅光開關(guān)蛋白的光調(diào)控能力明顯較低。 另一方面，使用MagRed的CPTS(Red-CPTS )在暗環(huán)境下幾乎檢測不到活性，通過紅色光照射可以高效地誘導(dǎo)基因表達(dá)，由此可知MagRed具有極高的光控制能力(圖3 )。 另外，通過使用Red-CPTS，通過紅色光照射，基因組中編碼的多個內(nèi)源基因也成功地同時激活了(通過紅色光照射，內(nèi)源基因的表達(dá)最多激活378倍)。 圖2 .用2.MagRed開發(fā)的紅光基因表達(dá)的光操作技術(shù)“Red-CPTS”。 為了操作基因組上目標(biāo)基因的表達(dá)，使用加入變異而失去DNA切斷活性的Cas9(dCas9 )。 作為使dCas9與DNA結(jié)合的向?qū)NA，使用插入了MS2 RNA適體的向?qū)NA。 MS2蛋白與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域( p65-HSF1 )連接MagRed。 紅光照射下，MagRed結(jié)合，dCas9結(jié)合的基因區(qū)域被激發(fā)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，因此可以針對該基因的表達(dá)進(jìn)行激活。 圖3 .與現(xiàn)有紅光開關(guān)蛋白的比較。
( a )生物發(fā)光報告顯示，采用MagRed的Red-CPTS在暗環(huán)境下幾乎不具有基因表達(dá)活性，響應(yīng)紅光照射強(qiáng)度表現(xiàn)出較高的基因表達(dá)活性。
用現(xiàn)有紅光開關(guān)蛋白( b:RpBphP1-PpsR2，c:RpBphP1-QPAS1)代替( b，c ) MagRed構(gòu)建基因表達(dá)的光操作技術(shù)，均在暗環(huán)境下表現(xiàn)出較高的基因表達(dá)活性，對紅光的響應(yīng)性明顯較低。( d )用各自暗環(huán)境下的響應(yīng)將a、b、c在紅光照射時的響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。 可見，MagRed的光調(diào)控能力明顯高于現(xiàn)有紅光開關(guān)蛋白。
此外，還研究了使用MagRed的紅光重組DNA反應(yīng)在光操作技術(shù)中的應(yīng)用。 催化DNA重組反應(yīng)的Cre重組酶(注10 )作為從基因組中敲除(刪除)目標(biāo)基因堿基序列的酶，在世界各地的研究室中被廣泛使用。 因此，通過將Cre重組酶分割為2個進(jìn)行失活，并在該分割體( split-Cre )上連接MagRed，開發(fā)出在暗環(huán)境下不具有DNA重組活性、在紅光照射下出現(xiàn)高活性的DNA重組酶( RedPA-Cre ) 將用紅光控制的4種現(xiàn)有技術(shù)與此次開發(fā)的RedPA-Cre進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)RedPA-Cre可以更高效地對DNA重組反應(yīng)進(jìn)行光操作(比較紅光和暗環(huán)境下的響應(yīng)比例，RedPA-Cre是現(xiàn)有技術(shù)哦) 此外，研究表明，將RedPA-Cre和上述Red-CPTS分別導(dǎo)入小鼠肝臟，通過生物體外無創(chuàng)照射紅光，均可在該器官中高效操作基因的作用(圖5、圖6 )。 圖4 .用4.MagRed開發(fā)的紅光重組DNA反應(yīng)的光操作技術(shù)“RedPA-Cre”。 開發(fā)了一種酶( RedPA-Cre )，通過將MagRed連接到將Cre重組酶分割為兩部分失活制備的split-Cre上，通過紅色締合，出現(xiàn)DNA重組活性。 紅光激活的RedPA-Cre可以從基因組中刪除被稱為loxP的34個堿基序列夾持的堿基序列(基因等)。 利用這種DNA重組反應(yīng)，可以用紅光瞄準(zhǔn)基因敲除基因，也可以激活基因。 圖5 .應(yīng)用5.RedPA-Cre在小鼠機(jī)體深部(肝臟)光操作DNA重組反應(yīng)。
( a ) LED從小鼠體外無創(chuàng)照射紅光的情況。
( b )肝臟導(dǎo)入RedPA-Cre和生物發(fā)光報告(與活化的RedPA-Cre反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光的報告)的小鼠，通過生物體外的紅光照射，觀察到了肝臟發(fā)出的生物發(fā)光信號。 這表明，即使是體外光照，在小鼠機(jī)體深部，RedPA-Cre也能高效誘導(dǎo)DNA重組反應(yīng)。 圖中的“p”表示p值。 “N.S .”表示無顯著性差異。 咨詢方式
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