| 【摘要】：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)是近幾年生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)特現(xiàn)象,具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的蛋白通過幾個短的堿性小肽組成的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomain,PTD)的介導(dǎo),能將與其共價連接的DNA、多肽或蛋白質(zhì)以及其他大分子物質(zhì)通過非經(jīng)典途徑穿過細(xì)胞膜甚至血腦屏障,并在細(xì)胞間自由傳遞。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(TAT-PTD)是源自人類免疫缺陷病毒HIV1蛋白的一段堿性氨基酸多肽,能夠?qū)⑴c之共價連接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部,在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和疾病治療等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。 來源于噬菌體P1的Cre/loxP系統(tǒng)目前已被廣泛用于原核、真核生物體內(nèi)與體外DNA重組方面的研究，并且在基因功能的鑒定、特定基因的刪除、染色體工程、基因捕獲以及外源基因的整合等方面發(fā)揮著巨大功能。 為了獲得穿膜效率高的Cre融合蛋白，將Cre基因克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)，使用人工合成編碼TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的DNA片段和來源于SV40大T抗原的核定位信號NLS序列，插入到Cre重組酶編碼區(qū)DNA的C-末端或者N-末端，組成不同構(gòu)象的重組表達(dá)子。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)使得重組Cre融合蛋白表達(dá)，利用組氨酸親和層析柱純化融合蛋白，用包含Cre功能檢測元件的293-C31-L2GFP細(xì)胞系，對純化出的融合蛋白進(jìn)行活性檢測，觀察各個融合蛋白的作用效果，并用流式細(xì)胞儀檢測效率。結(jié)果表明: 1、以質(zhì)粒pCAG-Cre-IP為模板，用PCR的方法擴(kuò)增出Cre基因的開放閱讀框序列。利用基因重組技術(shù)將目的基因克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌（DH5α），測序正確后連接于原核表達(dá)載體pET-28a(+)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建含有Cre、TAT及NLS序列的11個原核表達(dá)載體。 2、利用0.7mM IPTG在28℃條件下誘導(dǎo)7h，11個原核表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，用組氨酸親和層析柱純化融合蛋白并進(jìn)行Western blot鑒定，最后得到高純度的Cre融合蛋白。 3、細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在11個重組表達(dá)子中，His-NLS-TAT-Cre (HNTC)融合蛋白的穿膜效率最高，核定位效果理想，可作為哺乳動物染色體水平上基因操作的工具。 |
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