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2021年11月23日/醫(yī)麥客新聞 eMedClub News/--在去年新冠疫情爆發(fā)后，mRNA疫苗的高效研發(fā)帶動(dòng)了整個(gè)核酸藥物領(lǐng)域的高速發(fā)展，受到越來越多人的關(guān)注。國內(nèi)外資本瞄準(zhǔn)其龐大的市場空間及發(fā)展?jié)摿Γ娂姴季?，核酸藥物的研發(fā)成為全球最炙手可熱的領(lǐng)域之一。 與傳統(tǒng)的小分子藥物和抗體藥物相比，核酸藥物最大的優(yōu)點(diǎn)是研發(fā)時(shí)間大幅縮短，只需通過核酸序列設(shè)計(jì)的改變，就可以快速研發(fā)出不同的藥物。其中的細(xì)分領(lǐng)域—寡核苷酸（小核酸）藥物作為mRNA技術(shù)平臺(tái)之外的另一匹黑馬，得到了爆發(fā)式的增長，寡核苷酸通常由12-30個(gè)核苷酸單鏈或雙鏈組成，可分為反義寡核苷酸（ASOs)、小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）等。 最早的核酸藥物可以追溯到20世紀(jì)70年代。1978年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)ASO可與靶標(biāo)mRNA結(jié)合形成DNA/RNA雙鏈，進(jìn)而降解mRNA，使其喪失功能。1998年，第一款A(yù)SO藥物獲批，用于治療CMV視網(wǎng)膜炎。2004年第一款RNA aptamer藥物獲批，siRNA核酸藥物迎來了研發(fā)熱潮，多家大型企業(yè)紛紛進(jìn)入這一領(lǐng)域，但siRNA因其在人體內(nèi)不穩(wěn)定、易降解以及潛在的免疫原性等問題導(dǎo)致小核酸藥物研發(fā)一度擱淺。直到2013年，各種化學(xué)修飾技術(shù)的蓬勃發(fā)展推動(dòng)了小核酸藥物的進(jìn)展。2016年，F(xiàn)DA先后批準(zhǔn)了2款A(yù)SO藥物上市。2018年，世界上首款siRNA藥物patisiran獲FDA和EC批準(zhǔn)用于臨床治療。2019年，givosiran作為第二款siRNA藥物獲FDA批準(zhǔn)上市。2020年，為了應(yīng)對新冠疫情，F(xiàn)DA緊急授權(quán)使用了兩款mRNA疫苗。寡核苷酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn) 與科研研發(fā)測試不同，小核酸藥物所需的劑量通常需要高達(dá)μmol到mmol級別，常規(guī)的化學(xué)合成方法已無法滿足生產(chǎn)需求，在產(chǎn)業(yè)中通用的方法為固相合成法，整個(gè)反應(yīng)由4個(gè)步驟組成：分別為脫保護(hù)、偶聯(lián)、氧化和加帽：- 使用二氯乙酸或者三氯乙酸的二氯甲烷溶液去除去核苷酸上的5'-DMT保護(hù)基團(tuán)，暴露5'-OH，以供下一步偶聯(lián)。
- 在這一步核苷酸鏈得到延伸，亞磷酰胺單體與活化劑四唑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體，脫保護(hù)的5'-OH與亞磷酰胺四唑活性中間體形成新的磷氧鍵，并脫去四唑。
- 偶聯(lián)反應(yīng)生成的亞磷酯鍵，易被酸、堿水解，因此需將此處三價(jià)磷氧化（硫化）為五價(jià)的磷。被氧化后形成的磷酸二酯（或硫代膦酸二酯）鍵。磷酸二酯鍵（或硫膦二酯）上有一個(gè)2-氰乙基保護(hù)，該保護(hù)基可以使磷酸二酯鍵在后續(xù)的合成中更穩(wěn)定。
- 雖然偶聯(lián)的效率可以達(dá)到99%以上，但仍有一些已經(jīng)脫保護(hù)的5'-OH沒有參與反應(yīng)。為了防止這些5'-OH與下一個(gè)循環(huán)加入的亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生N-1雜質(zhì)。需要對未參與偶聯(lián)的5'-OH加帽。一般常用乙酸酐和N-甲基咪唑形成乙?；噭?，與未參與偶聯(lián)反應(yīng)的5'-OH形成酯鍵。
在寡核酸合成時(shí)，另外一個(gè)需要考慮到的就是對于核酸的修飾，為了讓寡核苷酸可以被更好的遞送到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，通常需要在合成時(shí)對寡核苷酸的主鏈、核糖或者核堿基進(jìn)行修飾。常見的修飾方法有：對主鏈骨架的修飾、對堿基的修飾、對2-OH核糖的修飾和核糖的修飾以及對替代化學(xué)物的修飾。此外，寡核苷酸偶聯(lián)其他分子物質(zhì)也是在合成中常見的修飾方法。目前所有的合成和修飾過程都可以直接借助寡核苷酸合成儀自動(dòng)合成，但由于中間涉及到多種試劑和復(fù)雜的合成步驟，自動(dòng)化水平及系統(tǒng)穩(wěn)定性成為了衡量寡核苷酸合成儀的重要指標(biāo)，其中的翹楚，來自Cytiva（原GE生命科學(xué)）Oligo系列寡核苷酸合成儀。下方是?KTA oligopilot plus的一些具體參數(shù)：?KTA oligopilot plus允許使用多達(dá)12種不同的合成單體，自動(dòng)合成多達(dá)七個(gè)不同的寡核苷酸序列，除此之外，我們還可以看到其他的一些特點(diǎn)：- 可使用磷酸二酯和/或硫代磷酸酯DNA、RNA寡核苷酸
- 1 μmol合成所需的循環(huán)時(shí)間低于5分鐘
- 不同生產(chǎn)規(guī)模的合成儀使用同一個(gè)控制系統(tǒng)Unicorn
- 過程分析技術(shù)(PAT)的在線監(jiān)測可以對電導(dǎo)率、UV-vis和壓力進(jìn)行在線監(jiān)測
小核酸藥物作為一個(gè)新的生物制藥技術(shù)平臺(tái)，現(xiàn)今已進(jìn)入到成熟階段，它展示出的顛覆性技術(shù)的特質(zhì)，將會(huì)改變慢性病的治療理念和策略。今后十年甚至二十年內(nèi)都是核酸制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重大窗口期。未來，新一代核酸藥物必然會(huì)成為藥物研發(fā)的主流方向！
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