【原】【雷說新藥】突破乙肝治愈困境的生力軍——RNA療法

新康界pro 2020-09-04

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乙肝流行情況

乙型肝炎是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染人體肝臟引起的急性或慢性肝病。當(dāng)人體的免疫系統(tǒng)不能消滅HBV，導(dǎo)致其在血液和肝臟中持續(xù)存在，則形成慢性HBV感染，其中較大一部分表現(xiàn)為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)，通常簡稱為“慢乙肝”。

隨著HBV疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白的普及，HBV感染的預(yù)防取得了顯著成果，從1980年代至2015年，5歲以下兒童新發(fā)感染率從4.7%降到了1.3%，但是存量患者群體仍然非常龐大。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的2017年全球肝炎報(bào)告，2015年全球約有2.57億慢性HBV感染者，當(dāng)年新確診的感染者有2200萬人，其中僅有170萬(8%)得到治療。全球每年近90萬人死于慢性HBV感染進(jìn)展的疾病，包括肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌。

據(jù)中國肝炎防治基金會估算，2020年我國乙肝病毒感染者約7000萬人，需要治療的約2000多萬，能夠接受規(guī)范治療的只有11%。中國肝癌的死亡順位由1990年的11位上升到2017年的第7位，肝癌患者中86%感染了乙肝病毒，6.7%為乙肝病毒和丙肝病毒合并感染。慢性HBV感染在全球范圍內(nèi)巨大的患者群體和較低診療率，意味著巨大的市場空間。

圖表1. 2015年全球慢性HBV感染者地區(qū)分布

來源：世界衛(wèi)生組織、中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

乙肝病毒生命周期

HBV是一種獨(dú)特的嗜肝DNA病毒，通過與肝細(xì)胞膜上受體，如鈉離子-?；撬釁f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTCP)相互作用，去除乙肝表面抗原(HBsAg)包膜蛋白和磷脂包膜。剩余的核心顆粒進(jìn)入肝細(xì)胞，再脫除核衣殼，即乙肝核心抗原(HBcAg)，將松弛環(huán)狀的雙鏈DNA(RC DNA)運(yùn)輸至細(xì)胞核內(nèi)。在HBV DNA聚合酶的作用下，RC DNA的缺口被補(bǔ)齊，形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。以cccDNA為模板，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前基因組RNA(pgRNA)和其他3種mRNA(preSRNA、SRNA、XRNA)，這些RNA翻譯得到聚合酶(Pol)、HBc蛋白、pre-core蛋白、表面蛋白(S、LS、MS)和HBx蛋白。前基因組RNA出核后，在逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶的作用下形成RC DNA，與核衣殼蛋白(HBc)組裝成核心顆粒。核心顆?？稍俅芜M(jìn)入細(xì)胞核補(bǔ)充cccDNA，或者在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)組裝成完整的病毒粒子，以出芽的方式脫離細(xì)胞，再去感染鄰近的肝細(xì)胞。

此外，pre-core蛋白可以經(jīng)過蛋白水解，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)形成乙肝e抗原(HBeAg)，3種表面蛋白(S、LS、MS)則在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成乙肝表面抗原(HBsAg)。HBeAg和HBsAg這兩種蛋白可以分泌到細(xì)胞外，而不必組裝成完整的病毒粒子。受感染肝臟細(xì)胞釋放的大量HBsAg會導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭，產(chǎn)生免疫抑制效果，在維持HBV感染的持久性中起重要作用。

圖表2. 乙肝病毒生命周期及相關(guān)療法

來源：公開信息、中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

慢乙肝的治愈類型

慢乙肝治愈的類型包括完全治愈(病毒學(xué)治愈)和臨床治愈(功能性治愈/免疫學(xué)治愈)。完全治愈(病毒學(xué)治愈)即血清HBsAg檢測不到，肝內(nèi)和血清HBVDNA清除(包括肝內(nèi)cccDNA和整合HBV DNA)，血清抗-HBc持續(xù)陽性，伴或不伴抗-HBs出現(xiàn)。HBV cccDNA可在肝細(xì)胞核內(nèi)形成微染色體，具有高度穩(wěn)定性，無需新的病毒進(jìn)入肝細(xì)胞即可自我補(bǔ)充(圖表2中3-4-5-7-8-9-3的循環(huán))。此外，HBV可以將雙鏈線性DNA整合到宿主DNA中，整合的基因組片段不能表達(dá)核心蛋白，但可以持續(xù)表達(dá)HBsAg。獨(dú)特復(fù)雜的基因組和復(fù)制模式使HBV難以從體內(nèi)徹底清除。

臨床治愈(功能性治愈/免疫學(xué)治愈)指完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續(xù)檢測不到，HBeAg陰轉(zhuǎn)，伴或不伴HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換(指HBsAg轉(zhuǎn)陰且抗-HBs轉(zhuǎn)陽)，殘留cccDNA可持續(xù)存在，肝臟炎癥緩解和肝組織病理學(xué)改善，終末期肝病發(fā)生率顯著降低。

圖表3. 慢乙肝的完全治愈和臨床治愈

來源：2019慢乙肝臨床治愈專家共識、中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

現(xiàn)有療法的局限

慢乙肝目前已批準(zhǔn)的療法包括直接作用于HBV生命周期中逆轉(zhuǎn)錄和DNA合成環(huán)節(jié)(圖表2中8-9)的直接抗病毒藥物(DAA)，即核苷(酸)類似物(NA)，以及免疫調(diào)節(jié)劑干擾素(IFN)類。

NA可強(qiáng)效抑制HBV復(fù)制，但不能直接抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性(圖表2中4)，從而無法有效抑制各種病毒蛋白如HBsAg的表達(dá)。長期治療后，cccDNA和HBsAg水平會逐漸下降，但HBsAg的陰轉(zhuǎn)率僅有0~3%，如果不轉(zhuǎn)陰則意味著未達(dá)到臨床治愈。最嚴(yán)重的是，NA停藥后HBV會迅速復(fù)制，這意味著患者需要長期甚至終身用藥。

圖表4. 全球用于乙肝治療的已上市的核苷(酸)類似物

來源：公開信息，中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

干擾素中具有抗乙肝病毒作用的為干擾素α(IFNα-2a、IFNα-2b)，以及長效的聚乙二醇化干擾素α(PEG-IFNα-2a、PEG-IFNα-2b)。干擾素通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能、促進(jìn)細(xì)胞因子表達(dá)、誘導(dǎo)并編碼多種抗病毒蛋白等作用于HBV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的雙重作用。干擾素可以增強(qiáng)HBV前基因組RNA(pgRNA)和核心顆粒的降解，抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄，從而減少病毒蛋白如HBsAg的表達(dá)。相比NA，干擾素單獨(dú)使用療程有限，效果稍好，如PEG-IFN單藥治療HBsAg陰轉(zhuǎn)率為3%~7%。然而，干擾素僅對部分患者有效，且耐受性較差。核苷(酸)類似物和干擾素除了單獨(dú)使用，也在被探索聯(lián)合療法，但最佳聯(lián)用策略，如具體藥物選擇、劑量、療程、同時給藥、序貫治療等，目前尚未確立。

慢乙肝現(xiàn)有療法能夠在一定程度上抑制HBV，部分逆轉(zhuǎn)炎癥和纖維化，能夠降低但不能消除肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)有療法的主要局限是對HBsAg清除率低，不能實(shí)現(xiàn)臨床治愈，更不能根除cccDNA和整合DNA實(shí)現(xiàn)完全治愈。慢乙肝現(xiàn)有療法的局限意味著巨大的未被滿足的臨床需求，因此全球許多制藥企業(yè)和研發(fā)機(jī)構(gòu)都在努力探索能夠提供臨床治愈甚至完全治愈的創(chuàng)新療法。

慢乙肝的在研創(chuàng)新療法

治療慢乙肝的方向可以分為直接抗病毒藥和免疫調(diào)節(jié)劑，前者針對病毒生命周期各環(huán)節(jié)，后者則針對人體的免疫系統(tǒng)(圖表5)。目前針對HBV復(fù)制周期的各環(huán)節(jié)，均有一些在研創(chuàng)新療法，包括病毒進(jìn)入抑制劑、cccDNA切割、轉(zhuǎn)錄抑制劑、聚合酶抑制劑、衣殼阻滯劑和釋放抑制劑。免疫調(diào)節(jié)劑包括針對先天性免疫的Toll樣受體(TLR)小分子激動劑和PD-1單抗，針對適應(yīng)性免疫的治療性疫苗和工程化T細(xì)胞?，F(xiàn)有的核苷(酸)類似物(NA)療法多為逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，針對此機(jī)制的在研創(chuàng)新療法較少。

圖表5. 全球用于乙肝治療的創(chuàng)新療法(部分)

來源：公開信息，中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

在創(chuàng)新療法中，進(jìn)入抑制劑(entry inhibitors)只能用于預(yù)防病毒感染，對于已進(jìn)展為慢性感染的患者則無法發(fā)揮治療作用，而且對于HBV進(jìn)入肝細(xì)胞的具體機(jī)制目前并不完全清楚，開發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較大。直接針對cccDNA的基因編輯尋求慢乙肝完全治愈，但是可能存在倫理和脫靶引起的安全性問題。免疫調(diào)節(jié)劑主要是生物制品，開發(fā)難度較大，已有眾多治療性疫苗失敗。

聚合酶抑制劑、衣殼阻滯劑和釋放抑制劑，相對于轉(zhuǎn)錄抑制劑處于HBV復(fù)制周期的下游，并不能直接阻止病毒各種蛋白如HBsAg的表達(dá)。HBsAg陰轉(zhuǎn)是慢乙肝臨床治愈的重要目標(biāo)，因此直接影響cccDNA轉(zhuǎn)錄和翻譯(圖表2中4-5)的轉(zhuǎn)錄抑制劑在作用機(jī)制上可能具有一定優(yōu)勢，目前較多的在研療法也印證了這一點(diǎn)(圖表5)。HBV轉(zhuǎn)錄抑制劑大多是基于RNA干擾(RNAi)機(jī)制的療法，屬于RNA療法。

RNAi(RNA interference，RNA干擾)的機(jī)制是長雙鏈RNA(dsRNA)或短發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA(hairpin RNA)被核酸內(nèi)切酶Dicer剪切為siRNA，再與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)，在解旋酶作用下脫去正義鏈，帶有反義鏈的RISC再與特定mRNA特異互補(bǔ)，降解mRNA或抑制其翻譯，達(dá)到靜默特定基因表達(dá)的效果(圖表6)。由于RNAi技術(shù)可以特異性靜默特定基因的表達(dá)，被積極用于開發(fā)針對罕見病、癌癥、病毒性疾病等的基因療法。

圖表6. RNAi的基本作用機(jī)制示意

來源：Asian J. Pharm.、中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

RNA療法

RNA療法的機(jī)理是使用能夠與mRNA通過堿基配對結(jié)合的寡核苷酸來影響mRNA的代謝。這些過程包括從mRNA前體(pre-mRNA)開始的mRNA剪接和成熟過程、mRNA的運(yùn)送、mRNA的蛋白轉(zhuǎn)譯，以及mRNA的降解。目前RNA療法主要包括ASO(反義寡核苷酸)、siRNA(小干擾RNA)和miRNA(小分子RNA)(圖表7)。

圖表7. RNA療法中三類藥物的比較

來源：公開信息、廣證恒生、中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

ASO藥物發(fā)現(xiàn)最早，獲批藥物較多。1998年FDA批準(zhǔn)了首個ASO藥物，Ionis公司的Vitravene(fomivirsen)，用于二線治療艾滋病人并發(fā)的CMV(巨細(xì)胞病毒)視網(wǎng)膜炎。2016年，Biogen/Ionis的ASO藥物Spinraza(nusinersen)獲批，成為首款治療兒童和成人脊髓型肌萎縮癥(SMA)的療法。2018年，Ionis公司的Tegsedi(inotersen)獲批，成為首款治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素介導(dǎo)的淀粉樣變性(hATTR)的療法。

ASO藥物是可以直接與靶標(biāo)mRNA相結(jié)合的單鏈寡核苷酸，親水性比雙鏈寡核苷酸弱，通過磷硫?；岣叻€(wěn)定性，增強(qiáng)與蛋白質(zhì)的結(jié)合和組織擴(kuò)散的能力。與ASO藥物不同，siRNA藥物是雙鏈寡核苷酸，親水性強(qiáng)，在組織中擴(kuò)散和被細(xì)胞吸收的效果都不好。對于雙鏈寡核苷酸的修飾主要有兩種方法，一種使用脂質(zhì)納米顆粒幫助運(yùn)送到靶點(diǎn)組織(主要是肝細(xì)胞)并保護(hù)核苷酸不被降解，另一種使用N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)修飾促進(jìn)siRNA被肝細(xì)胞靶向吸收。由此可見，siRNA藥物的修飾方法帶來的肝臟靶向性有利于研發(fā)治療慢乙肝的創(chuàng)新療法。

2018年FDA批準(zhǔn)了全球首個siRNA藥物，Alnylam公司的Onpattro(patisiran)，也是首款用于治療成年患者由hATTR引起的多發(fā)性神經(jīng)病的療法。2019年11月，Alnylam公司的又一款siRNA藥物Givlaari(givosiran)獲得FDA批準(zhǔn)，用于治療患有急性肝卟啉癥(AHP)的成年患者。隨著藥物遞送問題的突破，siRNA藥物將逐漸成為主流的RNA療法。miRNA只需要2-8位核苷酸配對就能發(fā)揮作用，通常作用于一個協(xié)同的網(wǎng)絡(luò)而非單條通路，相關(guān)技術(shù)還需要繼續(xù)研究。

慢乙肝的在研RNA療法介紹

針對慢乙肝的siRNA藥物主要靶向乙肝病毒的前基因組RNA(pgRNA)和3種mRNA(圖表2中4)，而ASO藥物通過與病毒mRNA結(jié)合阻止其翻譯為病毒蛋白從而抑制病毒復(fù)制。近年來有多款siRNA藥物和ASO藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，尋求慢乙肝的臨床治愈(功能性治愈/免疫學(xué)治愈)。

2020年8月27日-29日(中歐夏季時間)，歐洲肝病研究學(xué)會(EASL)組織的2020年國際肝病年會(ILC 2020)在線上召開。EASL是世界權(quán)威的肝病研究學(xué)會，其組織召開的ILC是全球肝臟病學(xué)領(lǐng)域最具影響力的國際會議之一。ILC展示肝病領(lǐng)域最佳臨床實(shí)踐和科學(xué)，介紹肝病學(xué)的最新趨勢，呈現(xiàn)科學(xué)前沿進(jìn)展。ILC2020 公布了全球范圍內(nèi)慢乙肝RNA療法的最新進(jìn)展，下面擇要介紹。

JNJ-3989

楊森(Janssen)與RNA療法公司Arrowhead于2018年10月簽訂協(xié)議，合作開發(fā)和商業(yè)化siRNA藥物JNJ-3989(ARO HBV)。ILC 2020公布了JNJ-3989與核苷(酸)類似物(NA)聯(lián)用治療慢乙肝1/2期研究(AROHBV1001)的2期臨床數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析的目的是評估研究從開始到結(jié)束(第392天，服用最后一劑JNJ-3989的48周后)，HBsAg、HBV RNA、HBeAg和乙肝核心相關(guān)抗原(HBcrAg)的持續(xù)應(yīng)答。持久應(yīng)答者定義為從第0天-第392天持續(xù)表現(xiàn)為HBsAg下降≥1log₁₀IU/mL(1個指數(shù)單位)的慢乙肝患者。

圖表8. siRNA藥物JNJ-3989+NA聯(lián)合療法作用機(jī)制示意

來源：Janssen、中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

分析結(jié)果顯示：97.5%的患者接受治療后HBsAg水平降低1個指數(shù)單位以上，并且在最后一劑JNJ-3989給藥后48周內(nèi)，39%(15/38)的患者表現(xiàn)為持久應(yīng)答；(2)HBV RNA、HBeAg、HBcrAg的降低在所有隊(duì)列都可見，且在HBsAg持久應(yīng)答者中更明顯；(3)JNJ-3898的試驗(yàn)劑量顯示出良好的耐受性，似乎具有良好的長期安全性。分析結(jié)果支持對JNJ-3989+NA聯(lián)合療法進(jìn)行更長時間的評估，目的是實(shí)現(xiàn)慢乙肝的功能性治愈。

GSK3228836

2019年，葛蘭素史克(GSK)以高達(dá)2.62億美元的里程碑付款和相應(yīng)的銷售分成，從專注于開發(fā)反義寡核苷酸(ASO)藥物的Ionis公司獲得了兩款乙肝在研療法的研發(fā)和推廣權(quán)益，其中一款為GSK3228836(GSK836，ISIS 505358)。該藥是針對所有HBV RNA的2'-MOE(甲氧基乙基)修飾的反義寡核苷酸，通過核糖核酸酶H1誘導(dǎo)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中HBV RNA的切割。

ICL 2020公布了GSK836的臨床2a期試驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括未經(jīng)治和接受穩(wěn)定核苷(酸)類似物(NA)穩(wěn)定治療≥12個月的慢乙肝患者，在第1、4、8、11、15和22天皮下注射GSK836(300mg)或安慰劑。對HBV影響的主要評估在第29天進(jìn)行，隨后進(jìn)行為期6個月的隨訪，觀察GSK836能否持續(xù)顯著降低HBsAg和HBV DNA低于定量檢測下限。

結(jié)果顯示，對于NA經(jīng)治的患者，接受GSK836治療的4例患者中有3例的HBsAg降幅超過3個指數(shù)單位，其中1例低于檢測下限，另有1例患者在第36天低于檢測下限。對于NA未經(jīng)治患者，接受GSK836治療的12例患者中有3例的HBsAg降幅超過3個指數(shù)單位對于6位接受GSK836治療的患者HBsAg水平下降3個指數(shù)單位以上，其中2例低于檢測下限(圖表9)。對于接受GSK836治療的16例患者，其中4例的HBsAg水平降到檢測下限之下，可視為實(shí)現(xiàn)了功能性治愈，治愈率25%。GSK計(jì)劃年底開始GSK836的2b期臨床試驗(yàn)。

圖表9. 第29天檢測到患者的HBsAg水平變化

來源：ICL 2020、中康產(chǎn)業(yè)資本研究中心

VIR-2218

2017年10月，領(lǐng)先的RNAi療法公司Alnylam與專注開發(fā)嚴(yán)重感染性疾病藥物的Vir Biotechnology簽訂獨(dú)家許可協(xié)議，授權(quán)后者臨床開發(fā)和商業(yè)化HBV項(xiàng)目VIR-2218(ALN-HBV02)。該藥通過皮下注射給藥，是首個采用Alnylam公司的ESC+(增強(qiáng)穩(wěn)定化學(xué)+)技術(shù)創(chuàng)制的GalNAc共軛siRNA藥物。在VIR-2218的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)中，正鏈上連接的GalNAc保證肝臟靶向性，負(fù)鏈中的乙二醇核苷酸(GNA)修飾既可增強(qiáng)體內(nèi)效能所需的代謝穩(wěn)定性，又能減少序列匹配脫靶效應(yīng)。VIR-2218靶向HBV全部轉(zhuǎn)錄物共有的HBx基因區(qū)域，旨在沉默全部10種基因型HBV的cccDNA和整合DNA的轉(zhuǎn)錄。

圖表10. VIR-2218的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制示意