MALDI-TOF MS 在微生物鑒定中的重要應(yīng)用及挑戰(zhàn)

菌心說 2021-05-06

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來源：小桔燈網(wǎng)

作者：quite

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS) 是應(yīng)用于臨床微生物檢驗領(lǐng)域的一種新技術(shù)。這一技術(shù)的出現(xiàn)為準(zhǔn)確地鑒定細菌、真菌和分枝桿菌提供了良好的工具。歐洲微生物實驗室首先開始使用MALDI-TOF MS。由于其簡便、高準(zhǔn)確性、快速周轉(zhuǎn)時間和低成本等優(yōu)點，使得該技術(shù)在全球微生物實驗室被廣泛采用。得益于質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定方面的飛速發(fā)展，國內(nèi)研究學(xué)者們也逐漸重視MALDI-TOF MS在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用。

歷史和發(fā)展

雖然在1975年已首次提出將質(zhì)譜用于細菌鑒定，然而當(dāng)時采用的電離方法會使蛋白質(zhì)片段化，所以阻礙了其有效分析的能力。20世紀(jì)80年代，有兩個團隊提出了類似的想法來檢測完整的大分子，一起發(fā)明了用MS研究完整田中耕一(Koichi Tanaka) 及蛋白質(zhì)的技術(shù)。其同事發(fā)明了一種使用混有甘油的超細金屬粉末來分析生物大分子且同時不破壞大分子的方法。為此，田中耕一被授予諾貝爾化學(xué)獎(與John Fenn和Kurt Wiith rich共享) [2]田中耕一發(fā)表研究的同時， Franz Hillen kamp和Michael Karas發(fā)表了使用有機化合物基質(zhì)煙酸進行軟解吸電離來分析生物大分子的研究[3]基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desorption MALDI) 這一術(shù)語亦來源于此。2006年，F(xiàn)ox在Journal of Clinical Microbiology上發(fā)表了第一篇有關(guān)質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物應(yīng)用的文章，引起同行關(guān)注，他認為該技術(shù)鑒定細菌還有許多技術(shù)難題要克服，不易成為常規(guī)方法，但是2009年后微生物質(zhì)譜技術(shù)迅速風(fēng)靡歐洲、北美和亞洲的一些國家?；|(zhì)輔助激光解吸電離離子源和飛行時間質(zhì)量分析器質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù)吻合了微生物專家的期待：操作簡單、鑒定迅速、低運行成本及自動更新的數(shù)據(jù)庫。在微需氧菌、厭氧菌、真菌及分枝桿菌等難培養(yǎng)微生物鑒定方面表現(xiàn)尤為突出，鑒定時間由數(shù)天推進到以分鐘和秒計算。新開發(fā)項目更是令人鼓舞，如無菌體液的直接鑒定、耐藥表型識別、致病毒素分析以及醫(yī)院感染病原體遺傳溯源等。

臨床應(yīng)用

耐藥性檢測

微生物實驗室不但要提供精確的病原菌鑒定結(jié)果，同時還要檢測其敏感性，為臨床醫(yī)生提供治療依據(jù)。常規(guī)的藥物敏感性試驗方法比較費時，一些酶聯(lián)免疫、凝集等方法只能局限于少數(shù)細菌。MALDI-TOF MS可為耐藥基因檢測提供一個很好的平臺，可以分析幾乎所有的耐藥機制，目前報道的方法主要基于下列幾種原理：分析抗菌藥物及被修飾后的產(chǎn)物；分析細胞組分；分析核糖體DNA甲基化；檢測突變等。

流行病學(xué)

微生物實驗室、感染控制人員和臨床醫(yī)師面臨的挑戰(zhàn)之一是在某個臨床菌株暴發(fā)流行時可以得到菌株代表分類的特異數(shù)據(jù)，如沙門菌、鏈球菌等，為了準(zhǔn)確得到血清型、亞型或其它分類，實驗室必須耗費更多的時間做進一步檢測，而且許多菌株分型需要特殊的試驗方法、儀器、耗材等。因此，條件有限的實驗室就需要外送做檢測，可能導(dǎo)致檢測時間延長、丟失重要的流行病學(xué)數(shù)據(jù)、增加檢測費用、結(jié)果不準(zhǔn)確等。但如果在微生物實驗室內(nèi)快速、準(zhǔn)確完成重要數(shù)據(jù)的結(jié)果將會幫助臨床醫(yī)師、護士、感控人員和衛(wèi)生機構(gòu)處理、追蹤感染病原菌并掌握其流行狀況。

目前，通過大量菌株的群、屬、種分析，以及許多菌株分型研究的深入，MALDI-TOF MS所具備的鑒定這些高度相關(guān)菌株的能力將使臨床微生物實驗室的影響力提升。將來可能出現(xiàn)更加精密的MALDI-TOF MS儀器，不但可以鑒定病原菌，同時可以快速、準(zhǔn)確地提供菌株的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，這將使臨床微生物實驗室在醫(yī)院感染控制、病原菌暴發(fā)、耐藥菌國家監(jiān)測及生物防御等領(lǐng)域扮演重要角色。

常見細菌的鑒定

常規(guī)微生物鑒定主要基于生化反應(yīng)、顯微鏡檢、免疫學(xué)或者分子生物學(xué)。這些分析方法專業(yè)知識要求較高，并且費時費力。等待結(jié)果期間臨床醫(yī)師會經(jīng)驗性使用抗菌藥物，然而有時是不合適或者錯誤的。現(xiàn)代臨床微生物實驗室需要快速、可靠和經(jīng)濟的方法來鑒定細菌，以便及早進行適當(dāng)?shù)目咕幬镏委?。質(zhì)譜技術(shù)將微生物鑒定從24~48h縮短到數(shù)分鐘，而且僅需分析極少的菌量（104~106 CFU/mL）。以16SrRNA基因測序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)譜儀正確鑒定率為90.0%~95.0%，遠高于以往的商業(yè)自動化鑒定系統(tǒng)。

獲NMPA認證的企業(yè)一覽

近幾年，國內(nèi)在MALDI-TOF MS儀器的研發(fā)與生產(chǎn)快速起步，涌現(xiàn)了一批科研人員和企業(yè)，大大推動了MALDI-TOF MS國產(chǎn)化的進程。MALDI-TOF MS將可能成為首個由中國企業(yè)掌握最領(lǐng)先核心技術(shù)，并引領(lǐng)技術(shù)發(fā)展的質(zhì)譜儀品類，這對我國在生物大分子分析研究、臨床分子診斷應(yīng)用等方面有極大的推動。由數(shù)據(jù)可看到，2020年到現(xiàn)在新獲批的國產(chǎn)飛行時間質(zhì)譜達9家。

挑戰(zhàn)

質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性依賴于菌種數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量，菌種數(shù)據(jù)庫信息不全將會限制鑒定準(zhǔn)確性，豐富菌種數(shù)據(jù)庫將有利于鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然自建數(shù)據(jù)庫可以提高鑒定率，但是耗時，需要專業(yè)技術(shù)人員及真菌學(xué)專家指導(dǎo)。此外，體外診斷認證的數(shù)據(jù)庫并不允許隨意增加，因此只能用于科研。其次，雖然MALDI-TOF MS能快速有效地鑒定細菌，但其對后續(xù)的抗菌藥物敏感試驗的指導(dǎo)意義還存在諸多爭議。

盡管MALDI-TOF MS所得到的結(jié)果一般是可重復(fù)的，但也有變化的可能。質(zhì)譜儀（不同類型及單個儀器、儀器年齡、儀器配置）、基質(zhì)和溶劑組成、制備方法、技術(shù)人員培訓(xùn)和能力、培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)基、菌株培養(yǎng)的時間和溫度）和生物學(xué)變異都可能影響其結(jié)果。所以，其規(guī)范化質(zhì)量控制策略仍需要被制定。另外，分離好的菌落必須經(jīng)過檢測，如果菌落沒有很好地被分離，則有可能有多種微生物存在，而占比少的菌種可能不被發(fā)現(xiàn)。

引用：

[1] FoxA. Mass spectrometry for species or strain identification after culture or without culture: past, present, and future[J]. J Clin Microbiol, 2006,44:2677-2680.

[2] 曹書娟, 劉彬, 朱安娜. MALDI-TOF MS在藥物基因組學(xué)檢測中的應(yīng)用及展望[J]. 分子診斷與治療雜志, 2020, v.12;No.65(01):121-125.

[3] 羅燕萍. 質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物實驗室中的應(yīng)用前景[J]. 檢驗醫(yī)學(xué), 2015(2):97-101.

[4] 田月如, 關(guān)明, 李敏. MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床微生物診斷應(yīng)用中的挑戰(zhàn)[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2018(8):559-562.