“聽過很多道理，依然過不好這一生”，韓寒的電影《后會無期》這句臺詞深深的直入觀眾心底，引起了我們的共鳴。相信很多科研汪們也有類似的感慨：

做過很多種實驗，依然得不到陽性結果；

投過很多遍文章，依然不能順利發(fā)表；

做過很多次WB(Western Blot)，依然做不出BCL-2……

最近，很多同學在做BCL-2的WB 實驗時，總是檢測不到條帶，問我是什么原因。一開始聽到這個問題，我還真不知如何回答，因為原因太多了， 比如：是不是樣本中該蛋白的表達不夠，是不是WB 實驗時轉膜方法不合適，是不是抗體選擇不對等等都有可能。還一些同學會問，為什么檢測到的條帶位置與說明書上的不一致？可能的原因也很多：蛋白有沒有徹底裂解，抗原表位有沒有被遮蔽，封閉液和抗體稀釋液是不是最佳的，抗體的特異性如何等。我們再一起來梳理一下如何優(yōu)雅快速的用WB 檢測出BCL-2蛋白。

遇到狀況時，具體問題具體分析，仔細排查原因（媽呀，又白板！ ——有問題，別喊媽，先自查）非常重要。可是，那么多次失敗的實驗真的讓我們徹底領悟快速成長了嗎？抑或這些經驗是否滲入到我們的基因（DNA） 中并指導我們的實踐了么？如果我們能領會很多道理的精髓，并付出不折不扣的行動，相信我們的這一生也不會太差，甚至會很美好。同樣，我們做WB, 也需要掌握其關鍵點，才能獲得一張賞心悅目的結果圖。那WB 成敗的關鍵點有哪些呢？我們認為大致有以下三點：

1 蛋白樣本的制備；

2 WB 實驗步驟的優(yōu)化；

3 抗體的選擇。

老生雖常談，但越談越有味。

蛋白樣本成功的制備是WB 實驗非常關鍵的一步。只有高質量高豐度的目的蛋白配上合適的抗體再加上最優(yōu)的WB 步驟，實驗的陽性結果才是妥妥的。因此，獲得完整徹底暴露抗原表位的目的蛋白很重要。而在裂解蛋白之前，我們還需要對要研究蛋白的前世今生有個深入的了解，很重要！很重要！很重要！

如果研究的目的蛋白在樣本中表達很弱或者根本不表達，我們是很難檢測到條帶的，或者根本就檢測不到。我們可以通過專業(yè)的數(shù)據(jù)庫和之前發(fā)表的文章來確定目標蛋白的表達情況。多數(shù)情況下，我們可從http://www. 或者從https://www.來看蛋白的表達情況。以BCL-2 蛋白的表達為例（圖1，來自于www.）, 我們可以看到BCL-2 只在少數(shù)細胞系中有中等或偏高的表達，如RPMI 8826，HL-60；這些細胞系的來源一般是骨髓或者淋巴。而SH-SY5Y細胞系中的BCL-2高表達也是因為RA(維甲酸)的誘導才產生。絕大多數(shù)細胞系如Hela，HEK-293，HepG2，PC-3及MCF7 等BCL-2 的表達是極其微弱的。對于表達很弱或者不表達的研究樣本，我們可以通過過表達或者體外進行誘導先讓BCL-2表達，再通過WB 或其他方法來做檢測。

圖1. BCL-2 各細胞系表達情況

了解了蛋白的表達情況之后，我們可以再通過閱讀一些影響因子較高的文獻（包括Article 和Review ）進一步了解該蛋白的一些背景知識，如蛋白的亞細胞定位和研究方法等，因為蛋白的定位決定了提取蛋白的方法。通過文獻總結，我們得知Bcl-2是一個與細胞生存有關蛋白，它通過抑制線粒體細胞色素c的釋放來抑制細胞凋亡的發(fā)生(1)。Bcl -2涉及線粒體鈣穩(wěn)態(tài)和離子通道調控(2)。Bcl-2常常在Thr56 Ser70，Thr74，Ser87位置發(fā)生磷酸化(3)。并且，Bcl-2磷酸化靶向ASK1 / MKK7 / JNK1通路且是有絲分裂標志事件(4、5)。Bcl-2在Thr56或Ser87的突變抑制了糖皮質激素誘導的T淋巴細胞凋亡 (6)。 白細胞介素3和JNK誘導的Bcl-2 Ser70磷酸化可以增強其抗凋亡功能(7)。研究顯示，BCL-2 是定位在胞質的核膜（圖2A）、線粒體膜（圖2B）和內質網膜上的（圖2C）。一些非特異性的條帶也可以通過超聲處理來避免。

圖2. BCL-2 亞細胞定位（來自參考文獻8）

因此在進行蛋白制備時，在冰上加入裂解液裂解后最好加上超聲處理這一步。超聲處理一方面通過機械力不斷剪切DNA，讓蛋白裂解液免受粘稠gDNA干擾；另一方面可以幫助蛋白從膜結構中充分釋放出來。

說了這么多，蛋白制備環(huán)節(jié)的關鍵在于兩點：1）充分了解要研究的目的蛋白及在研究樣本中的表達量；2）樣本制備的優(yōu)化條件是：加入適量Cell Lysis Buffer(#9803) 或者RIPA buffer(#9806) 于樣本中，冰上裂解15min，隨后進行超聲處理，以VirTis 探頭超聲儀為例，超聲條件是：輸出電功率是30%－40%，10-15s，3次(期間每次間隔15s)，大約電流30A；如果沒有超聲儀，請用帶注射器的針頭(20G-18G-16G)冰上反復抽吸，直到裂解液澄清；然后進行離心，取上清蛋白（適合絕大多數(shù)樣本的制備）。

WB 是非常基礎的實驗，很多同學都掌握得很好，具體原理和步驟就不再一一贅述了，我們把CST 科學家優(yōu)化的步驟分享給大家，大家在使用CST 抗體做實驗時若遇到問題，可以按以下步驟一一去調整：

1）轉膜條件：4度，濕轉，恒壓70v，30min-3h；對于小分子，轉膜時間適當減少，并用0.22um膜；對于大分子，轉膜時間延長至3h，轉膜液中可以加入0.1%SDS且甲醇的濃度減少到5%－10%；

2）封閉：5% 脫脂奶粉／TBST，室溫，1h，脫脂牛奶相比BSA具有更好的封閉效果；

3) 洗膜：1xTBST，5min，3次；

4）一抗稀釋液和稀釋比例參考說明書，二抗稀釋液是5% 脫脂奶粉/TBST。

圖3 BCL-2 在Jurkat 細胞中的表達（感謝湖南師范大學邱同學友情提供）

圖3是邱同學使用CST BCL-2 抗體的結果圖，一開始，該同學用 #3498 Bcl-2 (D17C4) Rabbit mAb (Mouse Preferred) 做實驗沒有條帶，經過超聲處理和以上方法的優(yōu)化后，做出實驗結果。當實驗檢測不到條帶的時候，我們可以用Jurkat 細胞裂解液作為BCL-2的陽性對照或者通過CST 申請相應的陽性對照。

關于抗體的選擇，我們之前寫過相關的文章，大家可以參考（原文報道：針對同一靶點的CST抗體那么多，怎么選擇？）。通過對全球科研工作者的調查，CST 抗體是研究者們的首選（原文報道：抗體使用者的選擇，堅定的信任！）。不知怎么選時，選C（CST） 就對了。

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結語

天底下有太多的道理，每個人對道理的理解和領悟不一樣而導致實踐千差萬別，因此人生結局各有不同；而我們做WB，不同的蛋白表達豐度和抗體識別的抗原表位不同，因此蛋白制備的方法和WB 的步驟決定了實驗的成敗。

人生和科研的精彩在于未知性，所以我們才樂此不疲地去設定一個個小目標，然后竭盡全力去實現(xiàn)，至于目標實現(xiàn)與否，只能“謀事在天”了?？蒲械臉啡ぴ谟谔剿魑粗?，當我們在實驗的過程中發(fā)現(xiàn)一個很有意思的現(xiàn)象，于是用各種實驗去驗證自己的假設，最終是“假象”還是“重大發(fā)現(xiàn)”，只能同樣“謀事在天”了。我想，享受科研與人生的過程，提升自己生命的內涵，掌握科學和實驗的key point，才能讓自己和世界更美好！

參考文獻：

(1) Murphy, K.M. et al. (2000) Cell Death Differ 7, 102-11.

(2) Zhu, L. et al. (1999) J Biol Chem 274, 33267-73.
(3) Maundrell, K. et al. (1997) J Biol Chem 272, 25238-42.

(4) Yamamoto, K. et al. (1999) Mol Cell Biol 19, 8469-78.

(5) Ling, Y.H. et al. (1998) J Biol Chem 273, 18984-91.

(6) Huang, S.T. and Cidlowski, J.A. (2002) FASEB J 16, 825-32.

(7) Deng, X. et al. (2001) J Biol Chem 276, 23681-8.

(8) Yuhihiro, Akao. Et al.(1994) Cancer Research 54,2468-2471.