WB 總是出現(xiàn)非特異性條帶怎么辦？

Avivaeqt299d83 2019-07-13

展開全文

好看的 WB 總是別人的，自己的 WB 總是雜帶叢生，尤其是新課題、新抗體，總在目的條帶附近出現(xiàn)非特異性條帶。

這個時候，不妨先思考幾個問題：

你的樣品類型是組織還是細胞？
如果是組織，提取物會傾向于有較高的背景和降解條帶。
如果是細胞，傳代是在 15 代以內(nèi)還是 15 代以上？
細胞系是否新鮮，有沒有加蛋白酶/磷酸酶抑制劑和超聲處理？

思考完這些問題，我們一起再從九個方面詳細分析一下，哪些因素會導致你的結(jié)果出現(xiàn)多條非特異性條帶：

-1-

原因：細胞系傳代次數(shù)過多，蛋白表達譜發(fā)生變化。

建議：使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細胞系（不超過 15 代）進行樣品制備。

-2-

原因：與細胞系裂解物相比，原代細胞或組織提取物會傾向于有較高的背景和降解條帶。

建議：用新鮮提取的，經(jīng)過超聲處理的澄清的組織提取物能降低背景；

同時，用去垢劑含量較高的 RIPA buffer 裂解組織，可得到裂解更徹底、一致性更高的裂解物。

-3-

原因：蛋白被降解。

建議：

提取液確保含有蛋白酶抑制劑，并超聲；
蛋白樣品提取后分裝－20 ℃ 或－80 ℃ 短期保存，避免反復凍融，有條件盡量用新鮮提取的蛋白。

-4-

原因：蛋白本身有很多修飾。

建議：查閱文獻，確定目的蛋白是否存在多種修飾，泛素化、糖基化等修飾會讓蛋白的條帶發(fā)生較大的偏移。

-5-

原因：所檢測蛋白存在多種剪接體，導致分子量大小不同。

建議：查閱文獻或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼 mRNA。

-6-

原因：蛋白存在二聚體或多聚體。

建議：SDS loading buffer 中現(xiàn)用現(xiàn)加 β－巰基乙醇或 DTT。

-7-

原因：樣本存在外源轉(zhuǎn)入蛋白。

建議：檢查所用樣本是否有過被外源進去帶有標簽的靶標蛋白。如有，更換細胞系樣本。

-8-

原因：上樣量過多。

建議：根據(jù)靶標表達情況，梯度上樣跑膠后選擇合適的上樣量，通常 20~50 μg 即可。

-9-

原因：實驗操作與 CST 推薦的步驟有較大出入。

建議：

CST 推薦封閉液用 5% 脫脂奶粉／TBST，室溫 1 h；
一抗稀釋液、稀釋比參考抗體說明書，推薦 4 ℃ 過夜孵育；
二抗用 5% 脫脂奶粉／TBST 稀釋，工作濃度切忌過高，室溫孵育 1 h；
要用 1XTBST 緩沖液充分洗滌。

我們通過兩個案例來具體分析下：

細胞系對結(jié)果影響非常大

實驗條件：檢測靶標 Phospho-Akt（Ser473）；使用抗體：CST #4060S Phospho-Akt（Ser473）（D9E）XP^? Rabbit mAb；細胞系：MCF7。

問題：出現(xiàn)非特異性條帶。Phospho-Akt（Ser473）（綠色）檢測出 2 條帶，一條在預測分子量 60 kd 左右，另外一條稍大，兩條 bands 強度差不多。紅色熒光為內(nèi)參蛋白 β-Tubulin。

圖 1. 引用自客戶技術(shù)咨詢案例

解決方案：建議客戶復蘇傳代較少的細胞，重新刺激、裂解之后，即得到了單一的條帶。

問題分析：AKT 激酶由 3 個分子量非常相近的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成：AKT1, AKT2 和 AKT3。Phospho-Akt（Ser473）正常情況下應(yīng)該只有 1 條帶，但在某些特定條件下，AKT 還可以發(fā)生糖基化、泛素化等修飾，從而造成蛋白大小發(fā)生改變。在這個案例的溝通中，我們發(fā)現(xiàn)客戶之前使用的細胞系傳代超過了 25 代，所以重新用較少代數(shù)的健康細胞，用了同樣的抗體，最終得到了單一條帶。

國內(nèi)許多實驗室細胞傳代并不嚴格記錄傳代次數(shù)，以至于很多老師使用的細胞自己也都不知道多少代，所以這些細胞系里蛋白表達譜是否發(fā)生變化，甚至這些細胞系是否有被其他細胞或支原體污染等問題也不得而知。因此，我們呼吁老師們重視細胞系的培養(yǎng)，定期排查細胞污染，控制傳代次數(shù)，只用健康的細胞，確保實驗可靠。

檢測到非特異性條帶還可能會發(fā) CNS

這個有意思的案例起源于生命科學聯(lián)合中心、北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院系統(tǒng)生物醫(yī)學研究所尹玉新教授課題組 2017 年的一篇發(fā)表在 Nature Communications 上的文章。作者先用全長的 PTEN 抗體檢測到一個比 PTENα 稍小的「雜帶」，同時「雜帶」的表達模式與 PTENα 類似（圖 2.a）。如果作者認定這個「雜帶」是抗體非特異性識別，不進行下面的深入研究，那就沒有這篇大文章了。

當時，作者在探究精神激勵下，又用只識別 PTEN C-terminal domain 的 CST 抗體 #9559 PTEN（138 G6）Rabbit mAb（圖 2.b）和識別 N 端的 PTENα 抗體（圖 2.c）在不同的癌癥細胞系中檢測，加上后續(xù)一系列分析和質(zhì)譜驗證，證實最開始看到的那條「雜帶」是和 PTENα 類似的 N-terminal extended PTEN isoform，后命名為 PTENb，從而使人們對 PTEN 蛋白家族及其功能的多樣性有了更深刻的認識。

圖 2. a~c 引用自尹玉新教授課題組 Nat. Commun. 8, 14771 文章的 Figure 1. ,d 來自網(wǎng)絡(luò)。

注：在 b 圖中可以看到，PTEN-null 的 PC3 細胞系中抗體并沒有任何條帶，證實其他細胞系中得到的 PTEN 條帶是特異的

如果一個蛋白有多個 isoforms，或蛋白同時發(fā)生多種翻譯后修飾（PTM），理論上只要 CST 抗體的抗原表位識別的區(qū)域在這些 isoform 或 PTM 的上面，并且蛋白的表達量達到可檢測水平，抗體都是能夠識別到的。這是 CST 抗體性能優(yōu)異的證明。

對于 CST 的抗體，都是內(nèi)部研發(fā)生產(chǎn)并且經(jīng)過多重交叉驗證之后才提供給客戶的，CST 盡全力保證出廠的抗體都具有高靈敏度、高特異性、高度可重復性。

如果您發(fā)現(xiàn)使用 CST 抗體檢測到「非特異性條帶」，先進行以下排查：

細胞樣本：有沒有被污染，有沒有傳代過久；組織樣本：存儲時間和條件是否得當，有沒有發(fā)生降解。
樣本提?。菏欠裥迈r提取，是否加蛋白酶/磷酸酶抑制劑，是否超聲。
有沒有嚴格按照網(wǎng)站上產(chǎn)品頁面提供的實驗步驟進行實驗操作。
查詢數(shù)據(jù)庫確認：靶標蛋白是否有多種 isoforms、影響蛋白大小的蛋白翻譯后修飾或容易出現(xiàn)多聚體等情況。

最后，祝大家好運！

案例中使用 CST 抗體，掃碼可直接購買：

#4060S Phospho-Akt（Ser473）（D9E）XP? Rabbit mAb ?

#9559 PTEN（138 G6）Rabbit mAb ?

另外，萬能的小伙伴，如果你經(jīng)常做 IHC & IF 相關(guān)實驗，可關(guān)注 CST 在 4 月 10 日至 6 月 27 日之間進行的「IF&IHC 產(chǎn)品大促」，凡購買 IF 或 IHC 相關(guān)抗體或試劑，滿足相應(yīng)等級的目錄價，即可獲贈相應(yīng)好禮，了解詳情，請掃描下方二維碼。

【參考文獻】

1. Liang, H. et al. PTENβ is an alternatively translated isoform of PTEN that regulates rDNA transcription. Nat. Commun. 8, 14771 doi: 10.1038/ncomms14771 (2017)

Cell Signaling Technology（CST）是由一批研究科學家創(chuàng)立的家族式私營企業(yè)，致力于提供高質(zhì)量的、創(chuàng)新的研究和診斷產(chǎn)品，以加速科學家對生物學的理解，并推動個性化醫(yī)療。其高質(zhì)量的產(chǎn)品和專業(yè)的研發(fā)精神已被全球客戶認可，被公認 / 票選為細胞信號研究的金標準、最佳抗體、研究者的首選、PTM（蛋白翻譯后修飾）抗體的領(lǐng)導者、生命科學領(lǐng)域最高引用試劑品牌、最激動人心的抗體驗證等！

CST 提供高品質(zhì)的特色信號蛋白及磷酸化、甲基化、乙?；?、泛素化、SUMO 化等翻譯后修飾抗體，蛋白翻譯后修飾篩選試劑盒及服務(wù)，還有偶聯(lián)抗體，二抗，ChIP 試劑盒，細胞因子，ELISA 試劑盒，細胞檢測試劑盒，蛋白實驗配套試劑等，為您提供蛋白相關(guān)實驗的一站式解決方案。

文章來源：CST 中國