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引物合成,你還差這幾個錦囊妙計

 生物_醫(yī)藥_科研 2018-12-07

引物對于常年混跡于實驗圈的各位來講,別提有多重要了:我們做PCR需要引物、做qPCR也需要引物,就連雜交實驗和高通量測序?qū)嶒炓残枰铩?/span>


但是你對引物真正了解多少,你真的會設計引物嗎?你知道怎樣保存引物最合適嗎?



無論是新手還是老手,相信看了這篇小編精心編輯的文章,都會對小編豎起大拇指

(想想我就激動了呢)


好了話不多說,讓我們打開序幕吧!





Q:
Primer設計的基本原則是什么?
A:
  • 引物長度一般在18-22bp;

  • G-C含量控制在40-60%左右;

  • 避免近3’端有酶切位點或發(fā)夾結構;

  • 如果可能避免在3’端最后5個堿基有2個以上的G或C;

  • 如果可能避免在3’端最后1個堿基為A;

  • 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn),特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn);

  • 退火溫度Tm控制在 55-65℃左右;

  • 如果是設計點突變引物,突變點應盡可能在引物的中間







Q:
如何測定引物的OD值?
A:

用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的光密度來定量。請注意紫外分光光度計的使用,測定時溶液光密度最好稀釋到0.2-0.8之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后,取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色杯中測定其光密度,即為所測體積的OD值,進而可以計算出母液的OD值。


舉例:您拿到一管干粉DNA,用1ml水溶解成母液,取該母液50微升稀釋成1ml并在1ml標準比色杯中測定的光密度為0.25,說明該50微升母液中含有0.25OD的DNA,也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。




Q:
如何檢測引物的純度?
A:

實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,進而更容易加樣。


600V電壓進行電泳,一定時間后(約2-3小時),剝膠,用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的。(有時由于變性不充分,主帶之上可能會有條帶,乃是引物二級結構條帶。)



Q:
為什么說用EB染色合成DNA片段來定量是不正確的?
A:

通??梢杂肊B染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA),是因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA,由于堿基組成不同,形成二級結構的可能性不同,EB的染色程度也會不同,比如Oligo(dT)等不形成二級結構,EB根本無法染色。


所以不要用EB染色的方法來定量,而用紫外分光光度計檢測。



Q:
如何計算引物的Tm值?
A:

引物設計軟件都可以給出Tm,引物長度,堿基組成,引物使用緩沖的離子強度有關。

  1. 長度為25mer以下的引物,Tm計算公式為:

    Tm = 4(G + C)+ 2(A + T)

  2. 于更長的寡聚核苷酸,Tm計算公式為: 

    Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size

公式中,Size = 引物長度。上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。



Q:
如何保存引物?
A:

我們提供的干粉DNA從有機溶劑中干燥出來,無菌,無核酸酶??梢允覝鼗?20℃密閉長期保存。


溶解以后的DNA最好保存在-20℃,溶解引物的水的PH要求大于7,并且無菌。帶有熒光標記的引物請注意避光保存。



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