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引物對于常年混跡于實驗圈的各位來講,別提有多重要了:我們做PCR需要引物、做qPCR也需要引物,就連雜交實驗和高通量測序?qū)嶒炓残枰铩?/span> 但是你對引物真正了解多少,你真的會設計引物嗎?你知道怎樣保存引物最合適嗎? 無論是新手還是老手,相信看了這篇小編精心編輯的文章,都會對小編豎起大拇指 (想想我就激動了呢) 好了話不多說,讓我們打開序幕吧!
用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的光密度來定量。請注意紫外分光光度計的使用,測定時溶液光密度最好稀釋到0.2-0.8之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后,取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色杯中測定其光密度,即為所測體積的OD值,進而可以計算出母液的OD值。 舉例:您拿到一管干粉DNA,用1ml水溶解成母液,取該母液50微升稀釋成1ml并在1ml標準比色杯中測定的光密度為0.25,說明該50微升母液中含有0.25OD的DNA,也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。 實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,進而更容易加樣。 600V電壓進行電泳,一定時間后(約2-3小時),剝膠,用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的。(有時由于變性不充分,主帶之上可能會有條帶,乃是引物二級結構條帶。) 通??梢杂肊B染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA),是因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA,由于堿基組成不同,形成二級結構的可能性不同,EB的染色程度也會不同,比如Oligo(dT)等不形成二級結構,EB根本無法染色。 所以不要用EB染色的方法來定量,而用紫外分光光度計檢測。 引物設計軟件都可以給出Tm,引物長度,堿基組成,引物使用緩沖的離子強度有關。
公式中,Size = 引物長度。上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。 我們提供的干粉DNA從有機溶劑中干燥出來,無菌,無核酸酶??梢允覝鼗?20℃密閉長期保存。 溶解以后的DNA最好保存在-20℃,溶解引物的水的PH要求大于7,并且無菌。帶有熒光標記的引物請注意避光保存。 現(xiàn)在,還要告訴大家一個驚喜:引物合成與測序積分換好禮活動正在如火如荼地進行著,好多禮品已經(jīng)火爆兌完,看了tips的你還在等什么,快去訂購我們的服務并且用訂單號換好禮啊~小編在活動頁面等著你哦。 |
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