引物合成介紹 
1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn)，無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。申能博彩公司采用的合成儀主要機型為ABI3900高通量合成儀，合成長鏈主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成儀，引物修飾和高OD數(shù)合成采用ABI394等。
亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。??第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；??第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
　第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時分離掉。??第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？
◆　C18柱脫鹽：有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。????
◆　OPC純化： OPC純化是根據(jù)DNA保護基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化。
◆　PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。?
◆　HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。?
3.引物的OD數(shù)如何定量？
答：引物合成引物OD數(shù)是這樣測定的：用紫外分光光度計，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。

4.投訴定量不準是怎么回事兒？
答：我們偶爾收到用戶投訴定量不準的報告，出現(xiàn)這種情況的可能性有（1）生產(chǎn)人員定量錯誤。這種可能性有，但是不大，因為我們的生產(chǎn)人員都是經(jīng)過嚴格的培訓(xùn)，程序化規(guī)范操作和換算。公司內(nèi)部的考核機制也使得分裝人員沒有必要故意少給用戶OD數(shù)，因為無論OD數(shù)是否達到定單要求，我們都統(tǒng)計為工作量，沒有達到OD數(shù)的，分裝人員將清單及時報到序列錄入部門安排重合就可以了。合成產(chǎn)量的高低是序列錄入部門人員的考核指標之一。一般情況下，引物都有留樣。接到用戶投訴后，我們都會找出留樣重新定量，一般都沒有問題。（2）分裝沒有問題，但引物抽干或收樣過程中，引物干粉可能意外丟失。這種情況很少見。（3）系統(tǒng)誤差，我們認為10%左右為允許誤差。使用過程中，引物工作濃度范圍很寬，定量上的少許偏差不影響實驗。（4）用戶沒有能夠正確理解引物OD數(shù)的含義，沒有能夠正確使用分光光度計，特別是使用微量測定；用戶沒有將OD讀數(shù)，正確地轉(zhuǎn)換成母液中OD數(shù)。這種情況比較常見。（5）用戶收到引物干粉時，打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作導(dǎo)致引物干粉部分丟失。
例如，驗證標2OD引物量是否準確，簡單的做法是： 加入1ml水，徹底溶解混勻后，取100ul, 加入900ul水，用光徑為1cm的石英比色杯，波長260nm, 此時光吸收的讀數(shù)為0.2。

5.需要什么級別的引物？
答：引物常用的純化方式C18脫鹽，OPC純化，PAGE純化，HPLC純化。根據(jù)實驗需要，確定訂購引物的純度級別。
應(yīng)用 引物長度要求 純度級別要求 
一般PCR擴增 < 45base OPC 
? >45 base PAGE 
診斷PCR擴增 < 40base OPC, PAGE 
DNA測序 20base左右 OPC 
亞克隆，點突變等 根據(jù)實驗要求定 OPC, PAGE，HPLC 
基因構(gòu)建（全基因合成） 根據(jù)實驗要求定 PAGE 
反義核酸 根據(jù)實驗要求定 PAGE 
修飾引物 根據(jù)實驗要求定 PAGE, HPLC 

6.最長可以合成多長的引物？
答：引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大。我們合成過120base的引物，但是產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，后續(xù)處理還有丟失很多，最后的產(chǎn)量是很低。

7.需要合成多少OD數(shù)？
答：根據(jù)實驗?zāi)康拇_定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求，其實也是對社會資源的一種浪費，同時也從一個側(cè)面反映了部分研究人員，特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復(fù)多次才能成功。

8.如何檢測引物的純度？
答：實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

9.如何計算引物的濃度？
答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核對合成報告單和引物標簽上的引物OD數(shù)是否一致。如果不一致，請和我們聯(lián)系。我們可以根據(jù)生產(chǎn)記錄查到實際產(chǎn)量是多少。
一般情況下，我們建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計算：V (微升)= OD數(shù)*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.

10.如何計算引物的Tm值？
答：引物設(shè)計軟件都可以給出Tm，引物長度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強度有關(guān)。
長度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size? ???????
公式中，Size = 引物長度。
Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. ?The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

11.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？
答：非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標示。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數(shù) x 堿基的平均分子量。或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團的數(shù)目和分子量。
對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個位置增加分子量16。
常規(guī)堿基分子量
Base Molecular Weight  
A 313.21 
C 289.18 
G 329.21 
T 304.19 
I 314.2 
U 290.17 

常規(guī)修飾基團分子量
5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49 
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46 
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07 
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18 
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12 


12.如何溶解引物？
答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。

13.如何保存引物？
答：引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復(fù)性要求較高，合成的OD數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需要避光保存。

14.合成的引物5’端是否有磷酸化
答：合成的引物5’為羥基，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5'端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5'或3'端進行磷酸化，需要另外收費。

15.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？
連接反應(yīng)需要引物的5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。

16.測序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？
答：測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯的機會不多。我們有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。
引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成效率最高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可能被細菌中修復(fù)系統(tǒng)補上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復(fù)制和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。
引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應(yīng)用到規(guī)?；a(chǎn)中。

17.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？
答：引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達到100%，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能絕對保證擴增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

18.如果測序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？
答：對您遇到的困惑，我們表示同情。遇到這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，我們在電腦中保留所有原始數(shù)據(jù)。如果確認引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。根據(jù)我們經(jīng)驗，40個堿基以下的引物，測1-2個克隆就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率?；蚱唇舆^程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。

19.如果測序發(fā)現(xiàn)引物突變，是否有補償？
答：沒有。我們可以免費重合一次，沒有其他任何補償或賠償，不承擔其他連帶責(zé)任。原因我們在前面已提到，化學(xué)合成效率不可能達到100%。您選擇了化學(xué)合成引物，合成過程中一些副產(chǎn)品所帶來的后果就可能不可避免的遇到。

20.引物是經(jīng)過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？
答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內(nèi)有一個不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問題可能就會少一些。

21.為什么OPC或PAGE純化的引物，再用HPLC鑒定純度不高？
答： 有些用戶引物需要純度特別高的引物，在使用前會將HPLC鑒定引物的純度，常常發(fā)現(xiàn)引物的純度一般在70%左右。問題來了，還有那30%是什么？ 引物純化PAGE, 需要電泳，用緩沖液將引物浸泡出來，然后用C18濃縮，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物質(zhì)基本引物了，除此以外，還有其他一些非核酸類物質(zhì)，他們一般不會干擾引物的使用。OPC純化也類似的情況。即使是HPLC純化的引物，如果對成品進行分析，一般也難達到很高的純度，引物您得到的純品都是由制備柱過來，洗脫峰經(jīng)過濃縮抽干，部分非核酸物質(zhì)被富集。

22.為什么修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低，價格要高?
答：主要因為是修飾單體穩(wěn)定性較差，偶連時間長，效率低，最后得到的產(chǎn)量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產(chǎn)品的價格自然高。

23. TaqMan 探針設(shè)計的基本原則是什么？
答：下列原則供您參考。
◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。
◆長度一般為18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。
◆在引物的5’端避免使用G。
◆選用比較多的堿基C。
◆退火溫度Tm控制在 68-70C左右。

有用的熒光染料參數(shù)
Name Name 吸收波長 發(fā)射波長 colors 
6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green 
TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange 
HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink 
TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose 
ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red 
Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red 
Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet 

24.Primer設(shè)計的基本原則是什么？
答：引物設(shè)計的下列原則供您參考。
◆引物長度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3’端有酶切位點或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
◆如果可能避免在3’端最后5個堿基有2個以上的G或C。
◆如果可能避免在3’端最后1個堿基為A。
◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。
◆退火溫度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是設(shè)計點突變引物，突變點應(yīng)盡可能在引物的中間。

25.用軟件設(shè)計的引物為什么不管用？
答：引物是否好用，能否擴增出您需要的引物，與是否用軟件設(shè)計沒有太多的關(guān)系。引物設(shè)計有一定的指導(dǎo)意見，軟件就是根據(jù)這些要求設(shè)計而成。不要迷信軟件給您設(shè)計的引物，軟件中一些參數(shù)您可能不明白，弄錯了反而麻煩。其實，PCR擴增的成敗最關(guān)鍵的是反應(yīng)模板的制備和反應(yīng)條件的控制。軟件設(shè)計最大的毛病是，有時判斷為該基因沒有一段區(qū)域滿足標準引物的要求。有時，我們需要擴增一段基因片段，引物的設(shè)計是沒有太多的選擇的。

26.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：我們多次接到類似的投訴：引物應(yīng)該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質(zhì)污染？遇到這樣的投訴有時我們感到很是為難。投訴者有時心情很不好，還不聽解釋。撇開其他不談，引物化學(xué)合成，哪里有機會污染到蛋白質(zhì)？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions 
Base Composition A260/280 
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50 
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85 
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15 
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14 
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66 

27.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？
答：通?？梢杂肊B染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA)，因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。同樣道理，用EB染色來照片不適合所有引物。

28.引物不純會有什么后果？
答：引物不純可能會導(dǎo)致：1)非特異性擴增；2)無法用預(yù)先設(shè)計在引物5'端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護堿基的引物；3) 用于測序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。

29.為什么我們的引物重合了幾遍都擴增不出來？
答：有些PCR擴增沒有成功，懷疑是引物不好。要求我們重合，沒有問題?？墒怯袝r遇到重合數(shù)次的引物PCR擴增還是不成功。這種情況的出現(xiàn)一般都是用戶自己的原因。對于引物合成，我們只能做到合成的引物沒有問題，至于您是否能夠擴增出來您需要的產(chǎn)物，那得靠您自己對實驗本身的理解和把握。我們不能杜絕我們不犯錯誤，但是引物合成犯同樣錯誤的幾率很小，想犯同樣的錯誤都難。
PCR擴增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在實驗時設(shè)置對照來判定原因。如果您懷疑引物的問題，請您首先測定您溶解的引物的OD值，看實驗時加入的引物量是否正確。如果量是正常的，請您告訴我司您的引物編號，我們會復(fù)查留存樣品。如不明原因，我們免費為您重新合成一次。如果仍然不能擴增，請您查找其它原因。

30.已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？
答：如果您溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復(fù)凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因為因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）, 引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不完全一致。

31.引物質(zhì)量好壞的判斷標準是什么？
答：合成的引物和您的定單序列一致，而不是能否擴增出您所需要的產(chǎn)物。

32.引物是我們設(shè)計的，現(xiàn)在您擴不出來，我們要負責(zé)嗎？
答：不負責(zé)任。我們免費為一些實驗經(jīng)驗不足的人員，免費設(shè)計引物。引物設(shè)計好，我們都會發(fā)給您確認。設(shè)計引物時我們遵循一般的指導(dǎo)原則，但是設(shè)計的引物是否能夠滿足您的實驗要求，擴增出您需要的基因片段，我們就不能保證了。我們遇到一些用戶，他們講：引物是你們設(shè)計的，也是你們合成的，我做不出，你們就要付責(zé)任。聽到這樣的抱怨，覺得心寒。

33.PCR擴增不出就引物有問題嗎？
答：基本不是。當今發(fā)展出各色各樣的PCR擴增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出，擴增效率低的問題。如槽式PCR就是擴增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。 有些重復(fù)片段的擴增, GC含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。
引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見（1） RT-PCR。請注意，很多基因通過常規(guī)RT –PCR方法是很難不增出來的。 RT- PCR成功的關(guān)鍵在于RT的反應(yīng)的RNA質(zhì)量和目標基因在特定組織和細胞中含量。（2）從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴格控制用量?；蚪MDNA過高，會影響反應(yīng)體系中的Mg和pH。

34.PCR擴增有很強的非特異條帶，說明引物有污染嗎？
答：不能。瞧，擴增目標很弱或沒有，道是非特異性條帶很亮，說明引物不純或有污染。一些用戶如是說。我們曾分析過一些非特異條帶，測序發(fā)現(xiàn)在這些非特異性片段的兩頭至少可以發(fā)現(xiàn)一條引物序列。我們只能說非特異性擴增一般是模板污染（如RNA中污染基因組）或擴增條件不合適所致。

35.引物合成的價格合理嗎，還有下浮的空間嗎？
答：不合理。對引物合成的成本，我們做了準確的統(tǒng)計和評估，認為現(xiàn)階段引物的價格處于一種非理性化狀態(tài)，價格已基本探底。引物合成的成本主要由四部分組成：（1）合成原料 （2）設(shè)備折舊 （3）人員費用 （4）場地和水電等消耗。其中合成原料占生產(chǎn)成本占30%，設(shè)備折舊占30%，人員費用占20%，場地和水電消耗等20%。我們的合成成本控制是相當?shù)轿?，原料管理也非常嚴格，原料進貨成本不可能高于同行。現(xiàn)行的引物合成價格，已讓我們感到十分吃力。我們需要對我們的用戶負責(zé)，我們需要體現(xiàn)做人的準則，我們需要交稅，我們需要收回設(shè)備的采購費用，我們需要給我們的用戶提供配套服務(wù)，這些需要才使我們還在做引物合成。引物合成業(yè)務(wù)的利潤空間可能還趕不上菜場上買魚