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根據(jù)測(cè)OD時(shí)光的波長(zhǎng)，波長(zhǎng)在紫外范圍就能夠測(cè)，如果不在，就不能測(cè)量。
非常感謝細(xì)履平沙.哪位能說(shuō)的具體一點(diǎn)啊,我想測(cè)枯草芽孢桿菌的OD,我不太知道是在多少nm下測(cè),我看過一些文獻(xiàn),上面說(shuō)細(xì)菌大概600nm,還是我自己摸索吸收波長(zhǎng)啊?另外是測(cè)吸光度還是透光率啊,空白用培養(yǎng)基做嗎. 請(qǐng)高人指點(diǎn),謝謝了. 一般測(cè)菌體密度的OD的波長(zhǎng)范圍是580nm-660nm 我們哪會(huì)兒測(cè)的(枯草芽孢桿菌)用600nm,已經(jīng)屬于可見光區(qū) 空白如用水做,需要離心洗滌菌體, 空白如用不接種的培養(yǎng)基做就不需要洗滌,但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng),以求條件一致 最后注意如果OD大于2.0,一般要稀釋后再測(cè),因?yàn)镺D太大了,分光光度計(jì)的靈敏度就會(huì)顯著降低 一般都測(cè)吸光值，而且最好是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，保持發(fā)酵液或菌體的稀釋倍數(shù)一致，吸光值與稀釋倍數(shù)不一定成正比，可保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)有可比性 一般OD值在控制在0 .1-0.4最好，在這個(gè)區(qū)內(nèi)的值就可靠，最好不要超過1.0 取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)最好。 測(cè)菌體密度的OD的波長(zhǎng)可以自己摸出來(lái)，看看用哪個(gè)波長(zhǎng)有最大吸收就可以了。 有合適的現(xiàn)場(chǎng)用的分光光度計(jì)推薦嗎？要求只用作菌濃的OD值測(cè)定，哪種最便宜的分光光度計(jì)可以選擇？ DNA合成常見問題及解答 Q: 怎樣對(duì)合成DNA制品進(jìn)行定量? A: DNA的量與260 nm處的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度計(jì)定量是最科學(xué)的。1個(gè)OD值的合成DNA的重量約為33 mg。 Q: 怎樣理解測(cè)定的OD值? A: 進(jìn)行OD值測(cè)定時(shí)，分光光度計(jì)上顯示的數(shù)值為每毫升溶液中的OD值。當(dāng)測(cè)定200 ml溶液中的OD值為1.5時(shí)，溶液整體的OD量應(yīng)該為多少？此時(shí)的OD值 = 1.5 OD/ml × 0.2 ml = 0.3 OD。 Q: 合成Oligo DNA應(yīng)怎樣保存? A: 保存合成的Oligo應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)： 1. 干燥制品很穩(wěn)定，常溫下數(shù)個(gè)月無(wú)問題。但為保證萬(wàn)無(wú)一失，放置于-20℃保存為好。 2. 溶解后的溶液DNA短期內(nèi)（1-2周）使用可放置在4℃下保存，長(zhǎng)期保存請(qǐng)放置于-20℃。溶解DNA時(shí)，請(qǐng)注意使用無(wú)菌、無(wú)核酸酶的水或TE Buffer。 3. 熒光標(biāo)記引物請(qǐng)避光保存。 Q: 合成DNA溶液在室溫下放置了數(shù)天，還可以使用嗎? A: 溶液中的Oligo DNA常溫下數(shù)天（3-4天）應(yīng)該沒問題，但最好不要放置一個(gè)星期以上。其壽命受溶液中的菌體、核酸酶等的影響。 Q: 制品溶解后發(fā)現(xiàn)有少許沉淀，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎? A: 所有的制品純化后都要進(jìn)行脫鹽，脫鹽是使用C18柱進(jìn)行的，偶而會(huì)有微量的樹脂溢出而進(jìn)入制品。樹脂不影響任何反應(yīng)結(jié)果，請(qǐng)稍許離心后取上清使用。 Q: 測(cè)定了制品的OD值后發(fā)現(xiàn)A260/A280< 1.8，制品質(zhì)量（純度）合格嗎? A: Oligo DNA和一般提取的雙鏈DNA不同，A260/A280的比值不能準(zhǔn)確衡量Oligo DNA制品的質(zhì)量，該比值依賴于序列中的各種堿基的組份，下表中列出了不同堿基組成的20mer的Oligo DNA的A260/A280比值。 因此，如果您測(cè)定了A260/A280的比值小于1.8時(shí)，是由于上述原因引起的。 Q: 為什么PAGE級(jí)和高純度級(jí)制品的提供量比其他公司少? A: 無(wú)論是PAGE純化，還是HPLC純化，增大每次的純化量會(huì)大大降低制品的純度。所以，為了保證制品質(zhì)量，我們一般把每次的純化量控制在2 OD左右。大OD量的提供對(duì)提高純度是不現(xiàn)實(shí)，不科學(xué)的做法。 一般，1 OD的20mer的DNA制品 (約5 nmol)，可以進(jìn)行200-400 次的PCR反應(yīng) (50 ml體系)，以及1,400次的測(cè)序反應(yīng)。因此，2 OD 的DNA量可以足夠進(jìn)行一般的實(shí)驗(yàn)工作。 Q: 我公司的DNA制品包裝中為什么不提供電泳照片? A:進(jìn)行過Oligo DNAPAGE電泳的人員都知道，同一OD量的不同序列的DNA制品電泳時(shí)的泳帶亮度（清晰度）是不一樣的。原因在于EtBr等染色劑的染色是滲透至DNA的雙鏈之間的，而合成的Oligo DNA是單鏈，OligoDNA自身形成的立體結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，EtBr的染色就越容易，DNA帶也就越亮。相反，有一些OligoDNA由于不形成立體結(jié)構(gòu)，根本就不為EtBr所染色。因此，我們認(rèn)為有些公司對(duì)所有產(chǎn)品都提供差不多同一亮度的制品的電泳照片是非常不現(xiàn)實(shí)的做法。 Q: 使用3%的Agarose凝膠電泳合成Oligo DNA制品，發(fā)現(xiàn)有很多條泳帶，為什么? A: Oligo DNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳。Oligo DNA是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，容易出現(xiàn)多條泳帶（更無(wú)法用Agarose電泳進(jìn)行定量了)。 Q: 進(jìn)行PAGE電泳時(shí)，長(zhǎng)度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置? A: 我們分析后認(rèn)為主要有以下原因： 1. A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同； 2. DNA的立體結(jié)構(gòu)不同，電泳速度不同。 這種情況在Oligo DNA越短時(shí)越容易發(fā)生，長(zhǎng)鏈Oligo DNA之間差別較小。 Q: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，為什么? A: 大部分廠家的說(shuō)明是：1. PCR過程的錯(cuò)配；2. 克隆過程的突變。 我們不能否認(rèn)這種可能性，但這種可能性實(shí)在太小，幾乎不可能。 對(duì)這種情況，我們經(jīng)過了認(rèn)真的分析，總結(jié)出了以下一些原因，供參考。 1. 合成機(jī)管路的瞬時(shí)阻堵，造成化學(xué)反應(yīng)的瞬間中斷，其結(jié)果可能會(huì)發(fā)生單個(gè)(或一部分)堿基的缺失。 2. 計(jì)算機(jī)程序失靈，控制錯(cuò)誤合成。 3. 合成過程中，堿基附加至DNA片段之前，堿基和堿基之間發(fā)生了偶聯(lián)，然后再附加到了DNA片段上，造成多堿基現(xiàn)象。 4. 合成時(shí)堿基G可能會(huì)轉(zhuǎn)化成烯醇異構(gòu)體，此時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)G會(huì)轉(zhuǎn)變成A。 5. 合成過程中的脫嘌呤作用，對(duì)脫嘌呤后的堿基DNA聚合酶不能識(shí)別，此時(shí)可能觀察到A或G的缺失。嘌呤含量越高，就越容易發(fā)生這種情況。 6. 不完全的脫保護(hù)結(jié)果。通常C脫得快，G脫得慢。不完全脫保護(hù)會(huì)發(fā)生堿基缺失。 7. 合成過程中的Capping（蓋帽）反應(yīng)不完全，使短片段DNA繼續(xù)參與合成，造成堿基缺失。 應(yīng)該說(shuō)，上述這些情況發(fā)生的可能性都極低。然而，合成的DNA鏈越長(zhǎng)，發(fā)生這種情況的機(jī)率也就越大。 Q: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯(cuò)誤，怎么辦? A: 1. 因?yàn)橐锛兌炔豢赡苁?00%，因此，挑選克隆時(shí)，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時(shí)，請(qǐng)重新挑選一個(gè)克隆測(cè)序，也許結(jié)果會(huì)變好。 2. 如果挑選2 ~ 3個(gè)克隆測(cè)序情況還沒改觀，我們會(huì)免費(fèi)重新合成引物。 進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)數(shù)個(gè)月不成功，后經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物處有錯(cuò)誤， 怎么辦? 1. 表達(dá)實(shí)驗(yàn)之前一定要對(duì)DNA序列進(jìn)行驗(yàn)證，這是實(shí)驗(yàn)的常識(shí)。 2. 我們可以免費(fèi)重新合成引物。 3. 如進(jìn)行索賠時(shí)，按國(guó)際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價(jià)格范圍之內(nèi)。 Q: 怎樣才能保證Oligo DNA的正確性? A: 1. 合成Oligo DNA時(shí)，選用高純度級(jí)制品。 2. 避免使用大于50mer的長(zhǎng)鏈Oligo DNA，最好選用小于35mer的合成DNA制品。 3. 進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，每次克隆都須進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以保證序列的正確性，然后再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，尤其需要注意。 Q: Oligo DNA最長(zhǎng)可以合成多少個(gè)堿基? A:以每步反應(yīng)效率為99%進(jìn)行計(jì)算，粗略計(jì)算合成到100個(gè)堿基時(shí)，目的DNA片段的比例便為0(精確數(shù)為37.0%)。但有些廠家曾報(bào)道合成了150mer的Oligo DNA片段。TaKaRa公司也曾合成過120mer左右的OligoDNA制品。但根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，要想保證合成DNA的堿基100%正確，OligoDNA的長(zhǎng)度最好不要超過70mer，80mer以上要想保證一個(gè)堿基不錯(cuò)就非常危險(xiǎn)了，須十分注意。 Q: 一般的合成Oligo DNA的5'和3'末端有P嗎? A: 沒有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加P，訂貨時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注明，此時(shí)需收取加P (P修飾) 的費(fèi)用。 Q: 平端的PCR產(chǎn)物難以克隆，為什么? A: 由于一般的PCR用引物的5'末端都沒有P，因此，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物的5'末端也沒有P。當(dāng)克隆于去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，無(wú)法克隆進(jìn)去；而當(dāng)克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時(shí)，背景會(huì)極高。此時(shí)請(qǐng)對(duì)PCR產(chǎn)物的5'端進(jìn)行磷酸 (P) 化處理。 Q: 合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)無(wú)目的帶，怎么辦? A: PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮。 1. 引物和模板是否配對(duì)，同源性有多大? 2. 引物本身是否有立體結(jié)構(gòu)，或者二條引物之間是否形成高次結(jié)構(gòu)? 3. PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作? 4. PCR儀是否工作正常? 5. PCR反應(yīng)條件是否合適? 如果一切正常，還無(wú)法解決問題時(shí)，我們可以免費(fèi)重新合成引物。 如果重新合成的引物也無(wú)法解決問題時(shí)，請(qǐng)把引物和模板寄送給我們公司，我們可以幫助摸索PCR反應(yīng)條件。 Q: 進(jìn)行反義DNA (Antisense DNA) 實(shí)驗(yàn)時(shí)，是否要對(duì)DNA鏈全部進(jìn)行S化修飾? A: DNA經(jīng)S化修飾后比較穩(wěn)定，在細(xì)胞中不會(huì)被核酸酶等分解。如果整條鏈全部修飾成S化DNA，的確能增加DNA的穩(wěn)定性，但此時(shí)會(huì)降低DNA和目的模板結(jié)合的效率。因此，現(xiàn)在一般的科研人員通常采用將DNA片段兩端的數(shù)個(gè)堿基進(jìn)行S化修飾，這樣既能取得保護(hù)DNA的效果，又能增加Antisense DNA和目的模板的結(jié)合能力。 即使如此，現(xiàn)在還是有很多科研人員采用了全部S化的修飾方法，并且能得到非常良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，任何一項(xiàng)科研工作都不是絕對(duì)的，因根據(jù)具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。 Q: Biotin標(biāo)記有三種，它們之間有何不同? A: ss-Biotin可提供比較長(zhǎng)的連接臂（臂長(zhǎng)約24.3 A），方便了Biotin與Avidin間的結(jié)合，而且分子中含有S-S鍵，除可以用8M鹽酸胍（pH1.5）分離Biotin與Avidin外，還可以使用還原劑（50mMDTT或100mM巰基乙酸）進(jìn)行分離。Imino-Biotin可提供較短的連接臂（約13.5A），其最大特點(diǎn)是Biotin與Avidin的分離可在較溫和的條件下進(jìn)行；8M鹽酸胍（pH4.0）。普通的Biotin提供與ss-Biotin相似長(zhǎng)度的連接臂，但只能用8M鹽酸胍（pH1.5）分離Biotin與Avidin。 Q: FITC、6-FAM、5-FAM標(biāo)記之間有何區(qū)別? A： 它們皆是熒光素標(biāo)記（Fluorescein)，三者結(jié)構(gòu)間的區(qū)別如下： 從結(jié)構(gòu)圖可見，5-FAM與6-FAM互為異構(gòu)體；而FITC則在與oligo的連接方式上（硫脲鍵）有別于前者（酰胺鍵)，但它們的發(fā)色團(tuán)均為熒光素，通常使用中沒有區(qū)別。 微生物OD值是反映菌體生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度。通常400～700nm 都是微生物測(cè)定的范圍，需要紫外分光光度計(jì)測(cè)最大吸收波長(zhǎng)。你是什么菌種？用得最多的就是505nm測(cè)菌絲菌體、560nm測(cè)酵母、600nm測(cè)細(xì)菌。用測(cè)OD方法畫微生物生長(zhǎng)曲線時(shí)，同一株菌的起始培養(yǎng)濃度可以準(zhǔn)備多管（根據(jù)檢測(cè)點(diǎn)的需要，如需檢測(cè)10個(gè)點(diǎn)，就準(zhǔn)備10管），然后每個(gè)點(diǎn)取一管出來(lái)測(cè)OD值就行了。 微生物OD值能用500NM測(cè)嗎 微生物OD值能用500NM測(cè)嗎 我用500nm的測(cè)過了才記起弄錯(cuò)了 對(duì)結(jié)果有影響嗎 應(yīng)該是有的，因?yàn)橐话悴捎肙D505nm,不過查一點(diǎn)點(diǎn)還是可以忍受的......你要是發(fā)酵罐的話就沒辦法了，只好湊合說(shuō)明問題，要是搖瓶之類的小型培養(yǎng)，沒時(shí)間的話建議趕緊做一瓶做個(gè)掃描看看光譜曲線 微生物OD值能用500NM測(cè)嗎，是否只能用600nm的測(cè) ？ 600nm是針對(duì)黃色培養(yǎng)物的,微生物培養(yǎng)后不一定都是黃色,象綠膿桿菌,所以有條件的話應(yīng)該測(cè)一下吸收峰. 為什么微生物的生長(zhǎng)測(cè)量在理論和實(shí)踐上有重要意義？包括那些反面？ 微生物的檢測(cè)，無(wú)論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義，本文分生長(zhǎng)量測(cè)定法，微生物計(jì)數(shù)法，生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測(cè)簡(jiǎn)要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標(biāo)的二十余種常用的檢測(cè)方法，簡(jiǎn)要介紹了這些方法的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。 概述： 一個(gè)微生物細(xì)胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并按自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量，體積，大?。┚筒粩嘣黾樱谑浅霈F(xiàn)了個(gè)體的生長(zhǎng)現(xiàn)象。如果這是一種平衡生長(zhǎng)，即各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L(zhǎng)時(shí)，則達(dá)到一定程度后就會(huì)發(fā)生繁殖，從而引起個(gè)體數(shù)目的增加，這時(shí)，原有的個(gè)體已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)群體。隨著群體中各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長(zhǎng)，就引起了這一群體的生長(zhǎng)，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標(biāo)來(lái)衡量。微生物的生長(zhǎng)不同于其他生物的生長(zhǎng)，微生物的個(gè)體生長(zhǎng)在科研上有一定困難，通常情況下也沒有實(shí)際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長(zhǎng)通常指群體的擴(kuò)增。微生物的生長(zhǎng)繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映。因此生長(zhǎng)繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問題的重要指標(biāo)，同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或是對(duì)致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長(zhǎng)抑制緊密相關(guān)。所以有必要介紹一下微生物生長(zhǎng)情況的檢測(cè)方法。既然生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測(cè)定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)，而測(cè)定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長(zhǎng)的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標(biāo)來(lái)進(jìn)行衡量。 生長(zhǎng)量測(cè)定法 體積測(cè)量法：又稱測(cè)菌絲濃度法。 通過測(cè)定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來(lái)反映微生物的生長(zhǎng)狀況。方法是，取一定量的待測(cè)培養(yǎng)液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間（如5分鐘）和轉(zhuǎn)速（如5000rpm），離心后，倒出上清夜，測(cè)出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡(jiǎn)便，快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有一定偏差。 稱干重法： 可用離心或過濾法測(cè)定。一般干重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1-5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40℃下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。 比濁法： 微生物的生長(zhǎng)引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定一定波長(zhǎng)下的吸光值，判斷微生物的生長(zhǎng)狀況。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長(zhǎng)作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)600nm 處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.Coli的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)時(shí)間。 菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法： 對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，借此衡量絲狀微生物的生長(zhǎng)。 微生物計(jì)數(shù)法 血球計(jì)數(shù)板法: 血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡(jiǎn)便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。 染色計(jì)數(shù)法： 為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧?，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無(wú)色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。 比例計(jì)數(shù)法： 將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。 液體稀釋法： 對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù)，從最適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN（most probablynumber）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測(cè)，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。 平板菌落計(jì)數(shù)法： 這是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法。將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9cm的平板上出現(xiàn)50-500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。 試劑紙法： 在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無(wú)色）待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。 膜過濾法： 用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。 生理指標(biāo)法： 微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值。 測(cè)定含氮量： 大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測(cè)定粗蛋白的含量。含氮量的測(cè)定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法。Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)?，收集在呼吸?jì)中，用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量。 測(cè)定含碳量： 將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無(wú)機(jī)緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值，即可推算出生長(zhǎng)量。需用試劑做空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 還原糖測(cè)定法： 還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè)。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。 氨基氮的測(cè)定： 方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02N的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況。 其他生理物質(zhì)的測(cè)定： P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長(zhǎng)。如我所在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細(xì)菌的長(zhǎng)勢(shì)。 商業(yè)化快速微生物檢測(cè)法： 微生物的檢測(cè)，其發(fā)展方向是快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，自動(dòng)化，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測(cè)原理，結(jié)合不同的檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測(cè)儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如： 1、抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測(cè)技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測(cè)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。中科院廣州分院合作產(chǎn)業(yè)處提供的抗干擾微生物培養(yǎng)基，新型生化鑒定管，微生物計(jì)數(shù)卡，環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)試劑盒等，可方便的用于多項(xiàng)檢測(cè)。 2、BACTOMETER全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)可以數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測(cè)結(jié)果，樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù)，對(duì)酵母和霉菌檢測(cè)同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（IMPEDANCETECHNOLOGY）將待測(cè)樣本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi)，底部有一對(duì)不銹鋼電極，測(cè)定因微生物生長(zhǎng)而產(chǎn)生阻抗改變。如微生物生長(zhǎng)時(shí)可將培養(yǎng)基中的大分子營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子，電阻抗法可測(cè)試這種微弱變化，從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測(cè)微生物的存在及數(shù)量。測(cè)定項(xiàng)目包括總生菌數(shù)，酵母菌，大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。 用分光光度計(jì)測(cè)微生物的OD值為什么要把波長(zhǎng)設(shè)為600nm 這個(gè)波長(zhǎng)其實(shí)只是針對(duì)濁度，而分光光度計(jì)在600nm處對(duì)濁度的反應(yīng)比較靈敏。測(cè)吸收峰的實(shí)際意義并不大，比如LB搖瓶培養(yǎng)過夜的大腸桿菌，其實(shí)在400多nm處的吸收最大，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰，我問過某幾個(gè)微生物雜志關(guān)于菌種鑒定等方面的資深審稿人（事實(shí)上我們?cè)谝粋€(gè)辦公室），他說(shuō)凡是文章里用測(cè)吸收峰來(lái)確定測(cè)濁度的波長(zhǎng)，他都會(huì)退稿的。 什么是OD600??？ OD600指的是某種溶液在600nm波長(zhǎng)處的吸光值。通過吸光值的定義可以知道，吸光值正比于溶液中的吸光物質(zhì)的濃度。 三樓說(shuō)的僅僅是這個(gè)參數(shù)的一個(gè)應(yīng)用，那就是利用細(xì)菌的吸光來(lái)測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度，從而估計(jì)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。 比如，測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)液在600nm出的吸光值，得到的OD600數(shù)值如果在0.6-0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600>3表明細(xì)菌已經(jīng)飽和等。 OD600還有別的用途，比如濃度測(cè)定、酶活測(cè)定等。 OD600是指菌體細(xì)胞密度. 監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,可以通過測(cè)OD600來(lái)監(jiān)測(cè) 細(xì)菌的生長(zhǎng)比較好的時(shí)期是在OD600為1時(shí),此時(shí)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)代等研究 在細(xì)菌的培養(yǎng)中,OD600超過0.8就要稀釋培養(yǎng)液! 一般大腸桿菌菌液的密度是多少？ 取決于你的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和通氣量（如為搖床，則為轉(zhuǎn)速）等多方面條件，很難說(shuō)的。 以600nm光密度記，一般搖床培養(yǎng)12小時(shí)，LB液體培養(yǎng)基，OD600可以達(dá)到2-3，但是在發(fā)酵館做高密度培養(yǎng)，能做到40-60個(gè)OD，這差距可是相當(dāng)?shù)拇蟆? 為什么采用560nm波長(zhǎng)測(cè)定酵母菌懸液的光密度？ 采用560nm波長(zhǎng)測(cè)定酵母菌懸液的光密度？如果在實(shí)驗(yàn)中需要測(cè)定大腸桿菌生長(zhǎng)的0D值，你將如何選擇波長(zhǎng)? 其實(shí)這個(gè)波長(zhǎng)也不是絕對(duì)的，我們也有用過460 nm，600nm等。一般來(lái)說(shuō)測(cè)量光密度是用來(lái)測(cè)量濁度，通過濁度來(lái)表示菌的濃度。那么這個(gè)波長(zhǎng)可以選擇和菌液比較相似的顏色，這就和培養(yǎng)基、菌本身的顏色等等都有關(guān)系。比如在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸桿菌一般可以用600 nm左右，但你用560nm也無(wú)不可。另外這和儀器也有關(guān)系，最好是選擇當(dāng)前儀器能測(cè)量得比較準(zhǔn)的那個(gè)范圍的波長(zhǎng) |
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來(lái)自： bengua1985 > 《專業(yè)》
