背景

‘Who is doing what’ 是微生物生態(tài)學領(lǐng)域及其重要的問題。16S rRNA基因測序技術(shù)解決了“Who”，鳥槍宏基因組學技術(shù)可以部分解決“What”。但是將兩者聯(lián)系起來十分困難。目前將系統(tǒng)發(fā)育和功能結(jié)合的主要方式是單細胞流式細胞儀篩選+全基因組擴增+擴增子高通量測序。但是這種方法在通量、試劑成本及實驗室配置上仍存在較大的制約?；诖藛栴}，2016年一篇ISME介紹了一種廉價的、高度并行的、高通量的方法來探究任意一個微生物群落中Who is doing what——epicPCR。

原理

epicPCR全稱Emulsion, Paired Isolation and Concatenation PCR，其目的是同時探究單個細胞內(nèi)的特定功能基因和系統(tǒng)發(fā)育的標記基因 (16S rRNA基因)。其方法結(jié)合了細胞分離、封裝與擴增。epicPCR基本原理如圖1-3所示。

(1)   乳化的方法能夠?qū)⒋髩K的反應分割成數(shù)以百萬個個體的反應，每一個反應都在一個小液滴中進行。這種方法在454和Ion Torrent測序平臺已經(jīng)得到了應用。乳液產(chǎn)生5億左右的液滴，每個大概一納升，每個液滴只包含一個細胞。細胞的裝載和擴散符合Poisson統(tǒng)計量，因此平均下來100個液滴中包含的細胞數(shù)小于1。每個包含細胞的液滴都含有丙烯酰胺單體，能夠聚合并封裝細胞，形成聚丙烯酰胺珠。聚丙烯酰胺珠為細菌核糖體和質(zhì)粒提供支持，并可以允許酶和引物進入。聚丙烯酰胺珠的直徑大概在5-30um，大多數(shù)的是10um。接下來乳液被破壞，丙烯酰胺珠中的細胞經(jīng)過酶處理破壞細胞壁、細胞膜和蛋白質(zhì)，將基因組DNA暴露出來。

(2)  二次乳化，通透的細胞與融合PCR (fusion PCR) 組分一起重新被封裝在乳液中。融合PCR在第二次乳化過程中進行，融合擴增只會在一個具有目的功能基因的給定細胞的乳液中形成。反應體系被聚丙烯酰胺珠封裝，保持每個反應的獨立性。首先線性擴增16S（R2），同時指數(shù)形式有限次循環(huán)的擴增功能基因（F1和R1-F2’）。有限次的擴增功能基因使用一個單端帶一個突起的引物 (R1-F2’)，該引物可與16SrRNA基因連接。當這種帶有突起的引物消耗殆盡，兩部分將會連接在一起繼續(xù)進行指數(shù)擴增（F1 and R2）。

(3)  然后利用巢式擴增，加上Illumina的adapters。熱啟動酶會阻止融合產(chǎn)物的延伸，保持單細胞的特異性。接下來blocking primers將會移除部分融合的產(chǎn)物。此步驟將會保留融合PCR的信息同時保持高通量。

(4)  乳液破碎之后，融合產(chǎn)物就可以進行高通量測序。得到的序列是來自同一個細胞的目的功能基因和16S rRNA基因的串聯(lián)體。

圖1 epicPCR基本原理

圖2 融合PCR示意圖

A．首先利用F1和R1-F2’指數(shù)擴增功能基因，同時利用R2線性擴增16S基因。R1-F2’在目的基因片段上加一個突起，可以與16S rRNA基因連接。F1和R2過量，所以R1-F2’在開始的若干輪PCR中被消耗。當R1-F2’被消耗，功能基因上的突起會接觸到16S基因，形成融合產(chǎn)物。融合產(chǎn)物再被F1和R2呈指數(shù)擴增。本文中F1和R2的濃度是1 μM, R1-F2′ 濃度是10 nM。

B．巢式PCR，加上Illumina測序的adapters。

C．功能基因和16S基因融合PCR的設計。第一行是原始設計，第二行是巢式反應的設計。

D．dsrB and the 16S rRNA gene的設計。

圖3 乳液中的細胞。A. 單個細胞被分散到單個液滴中。大部分液滴是空的。B．聚丙烯酰胺珠在第二輪乳化過程中攜帶細菌核糖體，作為融合PCR的模板。圖中熒光顯示的是聚丙烯酰胺珠中的細菌基因組，懸浮在乳化油中。

結(jié)果

考察了淡水湖中的硫酸鹽還原菌群落多樣性。選擇的功能基因為sulfate reductase gene dsrB。硫酸鹽還原過程是微生物在缺氧環(huán)境中利用硫酸鹽作為代謝過程的最終電子受體。分別取2m和21m的水樣。

圖4 通過16S rRNA基因與隨機barcode或者dsrB基因的融合考察epicPCR的特異性。陰性對照是聚丙烯酰胺珠與mock-16S擴增子。在epicPCR中barcode融合的出現(xiàn)信號，而與dsrB基因融合的沒有信號。陽性對照是聚丙烯酰胺珠與mock-16S和聚丙烯酰胺珠與mock- dsrB擴增子。在epicPCR中與barcode和dsrB融合的都產(chǎn)生信號。環(huán)境樣本中，barcode-16S組合在2m和21m都檢測到16S rRNA基因的信號。而硫酸鹽還原發(fā)生在厭氧環(huán)境，所以dsrB -16S組合只在21m檢測到信號。

應用

Epic-PCR通量高且非常廉價，與構(gòu)建一次基因組文庫價格相當，可運用于鑒定功能群落、追蹤水平基因轉(zhuǎn)移、記錄細胞之間的相互作用關(guān)系、研究物種驅(qū)動的生物地化循環(huán)、抗生素抗性基因等。

不足之處

由于擴增效率和液滴大小不是線性關(guān)系，目前產(chǎn)生的只是定性數(shù)據(jù)，而不能準確的定量。研究者也在不斷改進此方法，希望將來能夠得到定量的結(jié)果。

參考文獻

1. Spencer, S.J., et al., Massively parallel sequencing of singlecells by epicPCR links functional genes with phylogenetic markers. IsmeJournal, 2016. 10(2): p. 427-436.