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細(xì)胞內(nèi)融合基因技術(shù) (epicPCR) 測(cè)定功能類(lèi)群多樣性

Diversity of Functional Microbes Detected by epicPCR Technology

沈文麗¹，王尚² *，鄧曄^{2, 3}

¹山東大學(xué)海洋研究院，山東大學(xué)，青島，266237；²中國(guó)科學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京，100085；³中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京，100049

*通訊作者郵箱：shangwang@rcees.ac.cn

摘要：細(xì)胞內(nèi)融合基因技術(shù)是一項(xiàng)結(jié)合了單細(xì)胞分離、融合PCR、巢式PCR和測(cè)序技術(shù)的新型分子技術(shù)，不僅可以在未培養(yǎng)的單細(xì)胞中將功能基因與系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因 (如16S rRNA基因) 連接在一起，而且通量高，成本低。該技術(shù)首先通過(guò)稀釋和渦旋將樣品分散成單細(xì)胞體系，然后對(duì)擬研究的系統(tǒng)發(fā)育基因和功能基因進(jìn)行融合擴(kuò)增，隨后進(jìn)行巢式PCR，建庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序。細(xì)胞內(nèi)融合基因技術(shù)既能夠解決擴(kuò)增子測(cè)序物種信息與功能信息脫節(jié)的困境，又能夠克服大規(guī)模宏基因組測(cè)序成本高、分析難且研究對(duì)象僅是優(yōu)勢(shì)物種的局限。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞內(nèi)融合基因技術(shù)，功能基因，融合PCR，巢式PCR

材料與試劑

階段一：生成聚丙烯酰胺凝珠

1.1.5 ml、2 ml、50 ml離心管

2.PCR小管

3.35 μm細(xì)胞篩

4.0.2 μm濾膜

5.各種型號(hào)移液槍頭

6.雙蒸水

7.過(guò)硫酸銨 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: A3678)

8.N,N'-雙 (丙烯酰) 胱胺BAC (St. Louis, MO, USA, Sigma)

9.丙烯酰胺 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

10.Tris-HCl (pH 7.5)

11.氯化鉀

12.礦物油 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: M8410)

13.司盤(pán)80 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: 85548)

14.吐溫80 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: P8192)

15.四甲基乙二胺 (TEMED) (St. Louis, MO, USA, Sigma)

16.二乙醚 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

17.蛋白酶K (St. Louis, MO, USA, Sigma)

18.溶菌酶 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

階段二：融合PCR

1.2 mm玻璃珠

2.2 ml小管

3.各種型號(hào)移液槍頭

4.PCR小管

5.ABIL EM 90

6.Triton X-100

7.礦物油 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: M8410)

8.雙蒸水

9.5× Phusion HF 緩沖液

10.超保真酶Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (NEB)

11.50 mM MgCl₂

12.10 mM dNTPs

13.正向引物F1

14.反向引物R2

15.融合引物F2-R1

16.牛血清白蛋白BSA (molecular biology grade, NEB, Ipswich, MA, USA)

17.吐溫20 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

18.乙二胺四乙酸EDTA (St. Louis, MO, USA, Sigma)

階段三：破乳化釋放聚丙烯酰胺凝珠

1.1.5 ml、2 ml、50 ml離心管

2.各種型號(hào)移液槍頭

3.雙蒸水

4.二乙醚 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

5.乙酸乙酯 (St. Louis, MO, USA, Sigma)

6.AMPure XP磁珠 (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA)

7.無(wú)水乙醇

階段四：巢式PCR

1.1.5 ml、2 ml、50 ml離心管

2.PCR小管

3.各種型號(hào)移液槍頭

4.雙蒸水

5.超保真酶Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (NEB)

6.5× Phusion HF 緩沖液

7.50 mM MgCl₂

8.10 mM dNTPs

9.正向引物F3

10.反向引物R3

11.阻斷引物blockF

12.阻斷引物blockR

13.SYBR Green I 核酸染色試劑盒 (10,000 X, Invitrogen, Waltham, MA, USA)

表1. 本項(xiàng)目中融合硫酸鹽還原菌的功能基因dsrB和16S rRNA所使用的引物信息

溶液配方

1.丙烯酰胺溶液

12% 丙烯酰胺

0.32% BAC

2. 1×TK 緩沖液

   20 mM Tris HCl

   60 mM KCl

3. STT 乳化油 (14天內(nèi)可用，每次使用前需要顛倒混勻)

4.5% 司盤(pán)80

0.4%吐溫80

0.05%Triton X-100

v/v溶于礦物油中

4. ABIL 乳化油 (常溫儲(chǔ)存)

4% ABIL EM90

0.05%Triton X-100

v/v溶于礦物油中

儀器設(shè)備

階段一：生成聚丙烯酰胺凝珠

1.1.5 ml臺(tái)式高速離心機(jī)

2.各種型號(hào)移液槍

3.渦旋儀

4.超聲波清洗儀

5.超凈操作臺(tái)

6.通風(fēng)櫥

階段二：融合PCR

1.超凈操作臺(tái)

2.渦旋儀

3.PCR儀

4.PCR管離心儀

5.1.5 ml臺(tái)式高速離心機(jī)

階段三：破乳化釋放聚丙烯酰胺凝珠

1.1.5 ml臺(tái)式高速離心機(jī)

2.各種型號(hào)移液槍

3.通風(fēng)櫥

4.磁珠清洗磁力架

5.超凈工作臺(tái)

階段四：破乳化釋放聚丙烯酰胺凝珠

1.PCR儀

2.qPCR儀

3.超凈操作臺(tái)

4.各種型號(hào)移液槍

5.PCR管離心儀

實(shí)驗(yàn)步驟

一、生成聚丙烯酰胺凝珠

1.細(xì)胞懸浮液準(zhǔn)備

通過(guò)ATP等方法對(duì)樣品細(xì)胞懸浮液的濃度進(jìn)行定量檢測(cè)，稀釋得到30 μl包含1,400萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的樣品懸浮液。

2.制備聚丙烯酰胺凝珠

2.1混合30 μl細(xì)胞懸浮液 (1,400萬(wàn)個(gè)細(xì)胞) 、200 μl丙烯酰胺溶液 (12%丙烯酰胺和0.32% BAC) 和25 μl過(guò)硫酸銨溶液 (10%) ，輕輕渦旋混勻。

2.2在2 ml圓底離心管中，加入STT乳化油600 μl，然后加入2.1混合所得的水性懸液 (體積255 μl) ，3,000 rpm渦旋30 s，產(chǎn)生約5億個(gè)液滴 (按照液滴平均直徑10 μm計(jì)算) 。

注：STT乳化油由司盤(pán)80、吐溫80、聚乙二醇單辛基苯基醚和礦物油配置完成后14天內(nèi)可用，每次使用前需要顛倒混勻。

2.3加入四甲基乙二胺 (TEMED) 25 μl，催化聚合反應(yīng)，3,000 rpm渦旋30 s。

2.4乳化液靜置90 min聚合，生成如圖1所示的聚丙烯酰胺凝珠。

3.二乙醚提取聚丙烯酰胺凝珠

3.1在2.4乳化液中加入水飽和二乙醚800 μl，立即輕彈顛倒混勻，形成可見(jiàn)沉淀；用移液槍移走乳化油和乙醚的混合物，添加1 ml超純水，顛倒離心管混勻。

3.2將所有樣品轉(zhuǎn)移至新離心管中，離心12,000 x g 30 s，形成上層油層、中間水油混合層和下層聚丙烯酰胺bead。

3.3采用移液槍移取上層油層后，加入超純水洗滌，顛倒混勻，繼續(xù)用移液槍移取油層；重復(fù)加入超純水洗滌至不再有油層形成 (約5次) ；在最后一次水洗不再形成油層時(shí)，采用移液槍移取上層水。

3.4注入1 ml 1× TK緩沖液，重懸浮珠子于緩沖液中；用35 μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，過(guò)濾完成的聚丙烯酰胺凝珠保存于4 °C。

圖1. (a) 下層白色膠質(zhì)物為生成的包裹細(xì)胞的聚丙烯酰胺凝珠；(b) 熒光顯微鏡下聚丙烯酰胺凝珠及其中包裹的單細(xì)胞微生物

4.細(xì)胞溶解 (可選)

添加0.8%的溶菌酶 (35,000 U/μl) ，于37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。離心，移除上清；重懸浮在1× TK緩沖液中。用20%蛋白酶K (1 mg/ml) 和0.8%TritonX-100處理，37 °C培養(yǎng)30 min，然后95 °C培養(yǎng)10 min，重懸浮在1× TK緩沖液中。

二、融合PCR

1.配制PCR反應(yīng)混合體系，各組分的體積為1.1倍樣品數(shù)。

2.每個(gè)樣各分裝55.2 μl混合液到2 ml 離心管中，加入45 μl合成的聚丙烯酰胺凝珠，混合均勻。加入900 μl ABIL油，3,000 rpm渦旋1 min，充分振蕩混勻。

3.分裝60 μl反應(yīng)混合液到PCR小管中，每個(gè)樣約分裝16管。然后進(jìn)行PCR：94 °C 30 s, [94 °C 5 s, 52 °C 30 s, 72 °C 30 s] 33個(gè)循環(huán), 72 °C 5 min, 4 °C ∞。

4.反應(yīng)結(jié)束后，立馬將融合產(chǎn)物收集到1.5 ml離心管中 (將融合產(chǎn)物跑電泳，通?？床坏饺魏萎a(chǎn)物條帶，如圖2所示)。在每個(gè)收集的樣品中，加入終濃度為1 mM的EDTA，該樣品可在4 °C保存過(guò)夜。融合產(chǎn)物跑水平電泳通?？床坏饺魏螚l帶，如圖2所示。

圖2. 融合PCR后產(chǎn)物跑膠圖

三、破乳化釋放聚丙烯酰胺凝珠

1.破壞ABIL乳化體系，釋放凝珠

1.1將階段二生成的融合PCR產(chǎn)物在常溫下13,000 x g 離心5 min，棄上層油相。

1.2加入1 ml水飽和二乙醚至每個(gè)樣品中， (同體積水-乙醚混合液，混勻過(guò)程中輕起瓶蓋放氣) ，輕輕渦旋混合，13,000 x g 離心1 min，棄上層液相，重復(fù)該步驟一次。

1.3同樣的方法，用水飽和乙酸乙酯清洗2次。

1.4放在通風(fēng)櫥中吹10 min，使殘留的二乙醚盡可能揮發(fā)干凈，約收集100-150 μl產(chǎn)物。該產(chǎn)物可在4 °C保存數(shù)小時(shí)，在-20 °C保存過(guò)夜。

2.磁珠清洗PCR產(chǎn)物

2.1將磁珠充分搖勻，至于室溫中平衡至室溫 (10 min左右即可，最多30 min足夠) ，每100 μl DNA樣品中加入85.5 μl磁珠于1.5 ml離心管中，輕輕混勻，在室溫中孵育13 min，使DNA充分結(jié)合到磁珠上。

2.2將離心管置于磁鐵上，分離磁珠2 min，移除懸液 (不要將離心管取下) 。

2.3用0.5 ml 70%乙醇清洗磁珠2次 (不要將離心管取下) 。

2.4離心管保留在磁鐵上，打開(kāi)離心管蓋子，風(fēng)干15-30 min，直至管壁上沒(méi)有液滴，磁珠表面干燥。

2.5將離心管從磁鐵上取下，加入40 μl的緩沖液或無(wú)菌水，輕輕混勻，室溫中孵育7 min。

2.6將離心管置于磁鐵上2 min，收集35-40 μl懸液，保存在1.5 ml離心管中。

四、巢式PCR

1.巢式qPCR (可選)

1.1配制反應(yīng)混合液，各組分的體積為1.1倍樣品數(shù)

1.2每個(gè)樣分裝23 μl混合液至PCR小管中，加入2 μl純化的融合PCR產(chǎn)物以及水 (作為陰性對(duì)照) 。

1.3輕彈反應(yīng)液使混勻，將PCR管置于PCR管離心儀上離心片刻。進(jìn)行PCR過(guò)程：98 °C 30 s, [98 °C 5 s, 52 °C 30 s, 72 °C 30 s] 40個(gè)循環(huán), 72 °C 5 min, 4 °C ∞。

1.4根據(jù)qPCR Ct值評(píng)估不同樣本的最少循環(huán)數(shù)，可通過(guò)稀釋高濃度樣本，使不同樣本的循環(huán)數(shù)一樣。該P(yáng)CR產(chǎn)物可在4 °C保存數(shù)小時(shí)或者-20 °C過(guò)夜保存。

2.巢式PCR

2.1配制反應(yīng)混合液，各組分的體積為4× 1.1倍樣品數(shù)

2.2每個(gè)樣分裝63 μl混合液至PCR小管中，加入37 μl純化的融合PCR產(chǎn)物 (根據(jù)qPCR結(jié)果進(jìn)行稀釋) ，輕輕混勻，然后以25 μl體積進(jìn)行分裝。

2.3進(jìn)行PCR過(guò)程：PCR：98 °C 30 s, [98 °C 5 s, 52 °C 30 s, 72 °C 30 s] 40個(gè)循環(huán) (循環(huán)數(shù)根據(jù)qPCR結(jié)果確定) , 72 °C 5 min, 4 °C ∞。

3.將同一樣品的平行樣收集到1.5 ml離心管中，可以先用5 μl樣品跑水平凝膠電泳，觀察生成目標(biāo)產(chǎn)物情況 (如圖3所示)。若生成目標(biāo)產(chǎn)物，將樣品跑膠然后割膠純化，再用磁珠清洗 (方法同階段三步驟2) ，最后送測(cè)序。

圖3. 巢式PCR產(chǎn)物跑膠圖 (其中黃色箭頭所指為產(chǎn)物條帶)

結(jié)果與分析【可選】

本課題組采用細(xì)胞內(nèi)融合基因技術(shù) (epicPCR) 對(duì)采集自十個(gè)西藏鹽湖底泥的硫酸鹽還原菌群落的系統(tǒng)分類(lèi)和多樣性進(jìn)行了鑒定，并對(duì)影響該群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子進(jìn)行了鑒別。研究發(fā)現(xiàn)了十個(gè)新的硫酸鹽還原菌門(mén)，并由此表明，環(huán)境中尚有大量的未知硫酸鹽還原菌群類(lèi)別?？蓞⒁?jiàn)如下結(jié)果：

1.通過(guò)對(duì)融合的16S rRNA加dsrB基因的16S rRNA擴(kuò)增子和epicPCR產(chǎn)物的測(cè)序，共檢測(cè)到10個(gè)湖泊的微生物總?cè)郝涞?2,519個(gè)OTU和硫酸鹽還原菌群的883個(gè)SRP OTUs (表5) 。在微生物總?cè)郝浜土蛩猁}還原菌類(lèi)群中，變形桿菌、厚壁菌和擬桿菌是最主要的門(mén)，包括了最大比例的OTUs代表 (圖4) 。整個(gè)微生物群落和SRP亞群落的α-多樣性呈顯著正相關(guān) (R2=0.443，P<0.05) ，β-多樣性部分重疊 (圖5) ，揭示了兩者間的關(guān)系。

表5. 對(duì)西藏鹽湖中微生物總?cè)郝浜土蛩猁}還原菌群落的門(mén)，屬，以及OTUs水平的結(jié)構(gòu)比較

圖4. 微生物總?cè)郝浜土蛩猁}還原菌群落的OTUs的門(mén)的水平分類(lèi)。外餅為微生物總?cè)郝?/span>，內(nèi)餅為硫酸鹽還原菌群落。

圖5. 微生物總?cè)郝浜土蛩猁}還原菌的α-多樣性 (a) 與β-多樣性 (b) 的對(duì)比

2.按照epicPCR最初創(chuàng)始文章的方法，篩選出了120個(gè)高豐度的SRP-OTU (至少一個(gè)樣本中為1%) ，并對(duì)其構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)以觀察進(jìn)化分化 (圖6) 。這些高豐度的SRP-OTU與17個(gè)描述的門(mén)相關(guān)，其中只有7個(gè)廣為認(rèn)可的SRP門(mén)。類(lèi)似于微生物總?cè)郝涞拇蠖鄶?shù)OTUs，大多數(shù)SRP-OTUs只存在于某個(gè)特定的湖泊中， 證明了在西藏鹽湖中微生物群落和SRP亞群落的分布的地方特殊性。

圖6. 120個(gè)高豐度的硫酸鹽還原菌的OTUs的進(jìn)化關(guān)系。加黑字體為參考序列，藍(lán)色字體為廣泛分布的OTUs (每一個(gè)湖中均有高豐度存在) ，黑色字體為只以高豐度存在于某一個(gè)湖中的OTUs，紅色字體為高豐度存在于兩個(gè)以上的湖，但并不在每個(gè)湖中都有的OTUs。進(jìn)化枝上藍(lán)色圓形大小表示自展值的大小 (70-100) 。紅色進(jìn)化枝代表屬于新發(fā)現(xiàn)的十個(gè)硫酸鹽還原菌門(mén)的OTUs (圖下方 * 標(biāo)記的菌門(mén)) 。黑色柱形代表該OTUs相對(duì)豐度最高的湖中的豐度。彩色條形標(biāo)記門(mén)的水平的分類(lèi)。

致謝

感謝自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃培育項(xiàng)目 (項(xiàng)目號(hào)91851106) 以及國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目 (項(xiàng)目號(hào)32001092) 的經(jīng)費(fèi)支持！感謝MIT研究團(tuán)隊(duì)Spencer等人，該實(shí)驗(yàn)方案參考自Spencer等人于2016年發(fā)表在ISME Journl上的文章以及他們提供的詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程，在此表示特別感謝！

參考文獻(xiàn)

1.Spencer S J, Tamminen M V, Preheim S P, Guo M T, Briggs A W, Brito I L, D A W, Pitkanen L K, Vigneault F, Juhani Virta M P, Alm E J. Massively parallel sequencing of single cells by epicPCR links functional genes with phylogenetic markers. ISME J, 2016, 10: 427-436.

2.Qin H, Wang S, Feng K, He Z, Virta M P J, Hou W, Dong H, Deng Y. Unraveling the diversity of sedimentary sulfate-reducing prokaryotes (SRP) across xizang saline lakes using epicPCR. Microbiome, 2019, 7: 71.