脂肪組織在日常病理工作中非常常見，如脂肪瘤、胃腸道切取的網(wǎng)膜組織、乳腺周圍以及淋巴結(jié)周圍脂肪組織等。常規(guī)制片過程中，脂肪組織制成的蠟塊切片時常切成碎渣、缺損或空洞，很難切成完整的切片，但在實(shí)際工作中，又常常會遇到脂肪組織，例如化療過后的乳腺癌標(biāo)本，由于化療過后病變不明顯，需要多部位取材，難免會取部分較多脂肪的組織。那么，究竟怎樣才能制作出高質(zhì)量的石蠟組織脂肪切片呢？為此，我總結(jié)了一些脂肪制片的技巧方法，從制備切片的全流程與大家分享我的經(jīng)驗(yàn)。- 確定目標(biāo)脂肪組織區(qū)域，以專業(yè)的手法進(jìn)行采集，確保樣本的代表性。小心操作，防止對組織造成任何損傷。
- 采集后立即妥善保存樣本，避免其受到外界因素的干擾。
- 固定液的作用不可小覷，它能使脂肪組織的結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定。日常工作中我們推薦使用10%中性緩沖福爾馬林固定，用其固定組織效果明顯，對免疫組化、原位雜交、FISH、PCR、二代測序等檢查效果優(yōu)于其他混合固定液。
- 準(zhǔn)確選擇固定液，根據(jù)樣本大小確定合適的用量，一般至少應(yīng)為組織塊總體積的 5-10倍，也可達(dá)15-20倍，確保固定效果達(dá)到最佳。
- 一臺性能卓越的切片機(jī)是關(guān)鍵。檢查刀片的鋒利程度，確保能切出薄且均勻的切片。
- 準(zhǔn)備好干凈整潔的載玻片、蓋玻片以及各種必需的試劑和工具。
- 將脂肪組織樣本完全浸入固定液中，放置在適宜的環(huán)境下進(jìn)行固定。嚴(yán)格把控固定時間，既不能過長也不能過短。大多數(shù)組織在 10% 中性緩沖福爾馬林中應(yīng)固定 6-24h。固定的時間與使用固定液的種類、組織塊的厚薄、固定時的溫度等有關(guān)，不同的固定液有不同的固定時間。
- 設(shè)置適合的脫水機(jī)攪拌速度，讓固定液充分與組織接觸。
- 組織塊的大小厚度可根據(jù)組織類型而不同，但組織要得到良好的固定，原則上取材后組織塊厚度不應(yīng)超過4mm，3mm更為合適。取材大小建議不超過2cm×1.5cm×0.3cm。
- 按照順序使用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行脫水處理，70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇。精確控制每個濃度的停留時間，確保脫水效果均勻一致。
- 脫水過程中組織樣本應(yīng)充分的脫水和脫脂，組織內(nèi)含有水，二甲苯不能滲透到組織里，更無法將脂肪溶解。這就解釋了在日常工作中，由于乙醇在油脂中滲透速度比其它組織的滲透速度要慢的多，在有限的組織脫水時間里（需要在規(guī)定的時間內(nèi)完成），往往會導(dǎo)致較厚的組織或含脂肪的組織脫水不徹底，組織內(nèi)殘留的水分，阻礙了二甲苯有效的滲透到組織內(nèi)溶脂或替代乙醇的作用，造成組織浸蠟不充分，難以切片。
- 在二甲苯透明前，使用乙醇與二甲苯液處理60分鐘可以使脫水變得徹底。當(dāng)使用了無水乙醇和二甲苯混合液后，二甲苯可以將脫水干凈的外表脂肪迅速溶解，從而促進(jìn)無水乙醇的滲透，無水乙醇與二甲苯協(xié)同交替作用，達(dá)到一邊脫水一邊溶脂的功效，使脂肪或有脂肪包裹的組織得到充分的脫水與透明，保證石蠟有效的浸透，切片的完整性明顯提高。
- 把脫水后的組織放入二甲苯中，透明的目的是讓組織變得更加通透，為后續(xù)的浸蠟做好準(zhǔn)備。
- 謹(jǐn)慎掌握透明時間，避免過度透明或透明不足。
- 將透明后的組織放入熔化的石蠟中，讓石蠟充分滲透到組織內(nèi)部。合理控制浸蠟的溫度和時間，確保石蠟均勻分布。
- 將浸蠟后的組織放入包埋模具中，注入適量的石蠟，待其冷卻凝固成組織蠟塊。注意組織的擺放位置和方向，以便后續(xù)切片。
- 包埋時，對于脂肪組織，包埋時使用包埋錘按壓脂肪組織，盡可能的把脂滴擠壓出脂肪細(xì)胞，然后進(jìn)行包埋。
- 運(yùn)用切片機(jī)細(xì)心地將組織蠟塊切成薄片。調(diào)整好切片的厚度和速度，力求切出高質(zhì)量的切片。
- 保持手部穩(wěn)定，避免在切片過程中出現(xiàn)抖動。
- 那么經(jīng)過充分的固定、脫水、透明、浸蠟和包埋時均勻擠壓，還是不能得到完整的切片時，我們該怎么辦？為此我根據(jù)個人的經(jīng)驗(yàn)錄了一個小視頻，與大家一起交流學(xué)習(xí)。
- 將切好的切片放入溫水中使其展平，然后迅速撈起貼在載玻片上。注意防止產(chǎn)生氣泡和褶皺。
- 根據(jù)診斷需求選擇合適的染色方法。嚴(yán)格控制染色的時間和溫度，確保染色效果清晰美觀。
1.程序設(shè)置要點(diǎn)：脫水程序溫度設(shè)定范圍35℃左右；2.包埋過程中用眼科彎鑷將脂肪組織從塑料包埋盒中取出，置于組織包埋機(jī)工作臺加熱板上，將一直置于熱臺上的包埋錘在脂肪組織上從左到右從上到下來回輕輕均勻按壓，直至將脂肪組織中的脂滴完全擠出為止，將擠壓過的脂肪組織包埋制作成蠟塊。①脂肪組織較軟，選擇鋒利的切片刀，切片厚度以4-6μm為宜；②將蠟塊放在冷臺上或冰盤上冷卻，使脂肪組織變得更加硬實(shí)，有利于切片；③攤片機(jī)水槽內(nèi)溫度設(shè)置為40-45℃（水槽內(nèi)勿加酒精）；④切片切好后先不要急著烤片，將切片放在烘片區(qū)域蓋子上預(yù)熱一下，待多切幾張切片后再烤片，以此類推。4.定期對切片機(jī)等工具進(jìn)行檢查和維護(hù)，確保其正常運(yùn)行。②轉(zhuǎn)移貼紙裁剪規(guī)格大小與蠟塊大小相同；③轉(zhuǎn)移貼紙與蠟塊緊密貼合，中間無氣泡；④轉(zhuǎn)移貼紙用溫水浸濕，蠟塊用冷臺或冰盤冷凍，兩者之間形成溫差；做好石蠟組織脂肪切片是一項(xiàng)需要耐心和技巧的工作。只有用心做好每一個環(huán)節(jié)，才能制作出高質(zhì)量的切片，為科學(xué)研究和臨床診斷提供可靠的依據(jù)。讓我們以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度和精湛的技藝，開啟脂肪組織研究的精彩篇章。[1] 王德田，丁偉主編. 實(shí)用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù). 北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2022；13.[2] 梁忠泉,劉暢,楊志娜,謝永新,袁昌隆.脂肪組織石蠟切片制作方法探討[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2019,28(2):170-173.[3] 徐玉環(huán),徐艷峰,劉穎,黃瀾,于品,韓云林,李彥紅,趙文杰,鄧巍.脂肪組織切片制備方法的改進(jìn)[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2017,27(1):79-84.[4] 張萍,李小梅.探討影響脂肪組織病理切片質(zhì)量的因素[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2014,(3):248-249.[5] 丁偉,周立新,唐巍,應(yīng)李雄,姚洪田,張淼,唐蒙蒙,張晟.組織脫水過程中的脫脂方法[J].中華病理學(xué)雜志,2019,48(3):248-250.[6] 王德田，丁偉主編. 實(shí)用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù). 北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2022；13.本文轉(zhuǎn)載自重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，作者熊建波
|
