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病理技術(shù)的發(fā)展與現(xiàn)狀 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科 丁偉 病理學(xué)技術(shù)包括傳統(tǒng)病理技術(shù)和現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)。傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)（HE切片、特殊染色）是病理學(xué)的基礎(chǔ)，大量應(yīng)用于日常工作中，是提高診斷水平和現(xiàn)代病理技術(shù)的保證?；仡欉^(guò)去，病理學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)，無(wú)一不是新技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用的結(jié)果。同時(shí)新技術(shù)的應(yīng)用，也受到病理診斷水平和科研能力的制約。病理學(xué)經(jīng)歷了組織病理、超微病理、免疫病理和分子病理階段。免疫病理在很大程度上解決了很多疾病的性質(zhì)和來(lái)源，而分子病理學(xué)進(jìn)一步揭示了發(fā)病機(jī)制（特別是病毒學(xué)檢查），預(yù)后以及外源性基因在人體內(nèi)的存在和內(nèi)源性基因的突變和表達(dá)異常，解決了一些用蛋白水平不能解決的問(wèn)題。 目前，我國(guó)病理技術(shù)主要還是以常規(guī)HE、特染和免疫組化為主，整體水平不高，處于中等以下水平。我這樣說(shuō)也許有很多技術(shù)員會(huì)有意見(jiàn)。請(qǐng)看一個(gè)數(shù)據(jù)：2004年，中國(guó)病理學(xué)工作委員會(huì)在全國(guó)最具代表性的15家3級(jí)甲類(lèi)大型醫(yī)院病理科，對(duì)5個(gè)抗體的免疫組化質(zhì)量進(jìn)行測(cè)評(píng)，結(jié)果合格的只有3-4家，從一個(gè)側(cè)面反映了中國(guó)病理技術(shù)的現(xiàn)狀。而且這4家合格單位的成績(jī)還存在很多的水分：第一，所有切片的前處理都是由北京友誼醫(yī)院統(tǒng)一完成的，消除了各家由于固定、脫水、切片、烤片等原因引起的抗原損失的因素；第二，很多單位對(duì)這幾張片子都是精心加工的，并不代表平時(shí)的水平。也就是說(shuō)加上這二條，成績(jī)還會(huì)更差。要做好一、二張切片并不難，難的是要天天做好片子。 那么造成這樣的結(jié)果原因是什么？我想用我自己的經(jīng)驗(yàn)片面的分析一下： 一、技術(shù)員的定位 中華病理學(xué)會(huì)給技術(shù)的定位是在醫(yī)生指導(dǎo)下工作。這里容易給人造成二大誤區(qū)： 1、病理診斷與病理技術(shù)是二門(mén)完全不同的學(xué)科，對(duì)于病理技術(shù)而言，醫(yī)生是外行，技術(shù)員是內(nèi)行，讓外行來(lái)指導(dǎo)內(nèi)行，容易讓醫(yī)生錯(cuò)誤的認(rèn)為技術(shù)工作的簡(jiǎn)單性。 2、容易讓技術(shù)員產(chǎn)生被動(dòng)性和依賴性。 醫(yī)生說(shuō)什么我做什么，喪失了主觀能動(dòng)性創(chuàng)新性。出了問(wèn)題需要醫(yī)生指出原因才去改。由于很多原因醫(yī)生并不可能真正知道，導(dǎo)致很多問(wèn)題不能得到正確解決。 所以，分工明確，各盡其職，充分發(fā)揮技術(shù)員的主觀能動(dòng)性是提高技術(shù)水平的關(guān)鍵。醫(yī)生做好醫(yī)生自己的工作，技術(shù)員也應(yīng)該做好自己的工作。出現(xiàn)問(wèn)題，做醫(yī)生的只要指出自己需要什么，或者出了什么問(wèn)題，至于問(wèn)題的原因和解決的辦法，就應(yīng)該讓技術(shù)員自己的解決。只有這樣，才能培養(yǎng)技術(shù)員的獨(dú)立思考能力和解決問(wèn)題的能力，才能提高技術(shù)員的業(yè)務(wù)水平，才會(huì)讓技術(shù)員覺(jué)得知識(shí)的重要性以及享受到解決問(wèn)題的喜悅，才會(huì)領(lǐng)悟到工作的意義。 二、技術(shù)員本身的原因： 1） 技術(shù)員隊(duì)伍整體素質(zhì)不高，學(xué)歷偏低。大多數(shù)病理科技術(shù)員都是中專(zhuān)畢業(yè)，也有的是工人轉(zhuǎn)的，有的是護(hù)士轉(zhuǎn)的。我也反對(duì)唯學(xué)歷論，學(xué)歷并不能代表一個(gè)人真正的能力，但在大多數(shù)情況下，學(xué)歷還是能力的體現(xiàn)。經(jīng)歷了大學(xué)或研究生的培養(yǎng)學(xué)習(xí)，他們的知識(shí)面和考慮問(wèn)題的思路都是不一樣的。而低學(xué)歷的人要學(xué)超過(guò)他們，需付出更多的努力才能達(dá)到。 2）在主觀上不求上進(jìn)者甚多，我這樣說(shuō)會(huì)引起技術(shù)員的公憤，但事實(shí)的確如此，看一下自己周?chē)簺](méi)有理想，不思改進(jìn)，做一天算一天，已是很多技術(shù)員的通病。這就和我們的體制有關(guān)，只有通過(guò)崗位競(jìng)聘，才會(huì)讓技術(shù)員認(rèn)識(shí)到問(wèn)題的嚴(yán)重性。能上網(wǎng)關(guān)心技術(shù)的，都是好學(xué)的朋友，對(duì)整個(gè)技術(shù)隊(duì)伍來(lái)說(shuō)，還是極少數(shù)。 3）缺少正規(guī)的培養(yǎng)和學(xué)習(xí)的機(jī)會(huì)，很多技術(shù)員的技術(shù)都是師傅帶徒弟式的方法教的，也有的自學(xué)了；有的盡管出去進(jìn)修了，但學(xué)回來(lái)的并不一定是正確的，就是正確的，也要和自己科里的實(shí)際情況相結(jié)合，作出相應(yīng)的調(diào)整，才能真正做好。還有就是缺少相互交流的機(jī)會(huì)，有關(guān)技術(shù)的會(huì)議較少，技術(shù)員出來(lái)開(kāi)會(huì)的機(jī)會(huì)就更少。 4） 缺少橫向比較：我到過(guò)很多片子做的很差的單位，我發(fā)現(xiàn)醫(yī)生、技術(shù)員的自我感覺(jué)都很好，認(rèn)為自己做的很不錯(cuò)，對(duì)“好”沒(méi)有概念，如果不知道別人做的怎么樣，那么對(duì)切片質(zhì)量就沒(méi)有一個(gè)正確的認(rèn)識(shí)。有的人出去學(xué)習(xí)，走馬觀花，覺(jué)得沒(méi)什么好學(xué)的，別人做的和自己沒(méi)什么不一樣。諸不知每一個(gè)人的動(dòng)作都有差異，正因?yàn)檫@些細(xì)微的差異，導(dǎo)致了每個(gè)人切片質(zhì)量的不一樣。還有一些技術(shù)員，把一些不規(guī)范的甚至是錯(cuò)誤的東西當(dāng)成了經(jīng)驗(yàn)來(lái)宣傳、使用和推廣。 5）不能正確擺正自己的位置。 程天民院士曾經(jīng)說(shuō)過(guò)，診斷與技術(shù)是二個(gè)輪子，缺一不可，互為依存。這話有一定的道理的，但我認(rèn)為不夠確切，容易讓人主次不分，醫(yī)生與技術(shù)員的風(fēng)險(xiǎn)與價(jià)值是不能等同的。有的技術(shù)員什么事情都要和醫(yī)生比，當(dāng)二者出現(xiàn)差異后，醫(yī)技關(guān)系就開(kāi)始緊張，有的就和醫(yī)生頂著干，有的自暴自棄，有的甚至目空無(wú)人，孤芳自賞。我覺(jué)的任何事物都有主次，紅花總要綠葉配，沒(méi)有綠葉的紅花會(huì)怎么樣？但不能說(shuō)綠葉重要就可以做紅花。病理科也是一樣，醫(yī)生是主角，技術(shù)員是配角，技術(shù)員就是要配合醫(yī)生做好工作，你既然干了技術(shù)這個(gè)工作，就應(yīng)該有這樣的思想準(zhǔn)備，應(yīng)該正確的面對(duì)現(xiàn)實(shí)。病人來(lái)看病，總是沖著醫(yī)生的診斷水平來(lái)的，不會(huì)因?yàn)槟愕钠幼龅煤脹_著你來(lái)。我覺(jué)得病理科更像一輛列車(chē)，主任是車(chē)頭，醫(yī)生是車(chē)廂，技術(shù)員就像輪子。技術(shù)是決定火車(chē)額定速度的動(dòng)力，病理診斷就是司機(jī)，火車(chē)的好壞，動(dòng)力的大小，最終要通過(guò)火車(chē)跑的怎么樣來(lái)表現(xiàn)出來(lái)。最終火車(chē)開(kāi)的好不好，還要靠所有部件的齊心協(xié)力才行。 5） 技術(shù)員的地位 常聽(tīng)技術(shù)員說(shuō)現(xiàn)在技術(shù)員的地位越來(lái)越低了，于是就感到技術(shù)工作沒(méi)前途。我想這有二方面的因素，第一，你的工作有沒(méi)做好。第二，隨著社會(huì)的發(fā)展，改革的深入，對(duì)知識(shí)重視，醫(yī)生與技術(shù)員之間的差異會(huì)增大，我想這是正常的，我們不是整天叫中國(guó)要尊重知識(shí)嗎，不能因?yàn)閷?duì)自己不利就不滿意了，我們只有服從這個(gè)社會(huì)，而不能叫社會(huì)服從我們。人與人，工作與工作之間由于機(jī)遇不同，工作性質(zhì)不同，地位與待遇也就不同，沒(méi)必要比來(lái)比去。如果你不用心去做事，任何一個(gè)好工作對(duì)你來(lái)說(shuō)都沒(méi)有好前途。只要你把本職工作做好了，別人都會(huì)尊重你。在國(guó)外，有的國(guó)家的病理科技術(shù)員要比醫(yī)生早上班4 - 5個(gè)多小時(shí)（凌晨4點(diǎn)多），也就是說(shuō)在醫(yī)生到科前，你就要把昨天取材的組織做好，放在他的桌上。我想遲早，中國(guó)也會(huì)走上這條路。我想每一人都應(yīng)該有這樣的觀念：工作不僅是一項(xiàng)事業(yè)，也是一種謀生的手段，敬業(yè)，是為了更好的保住自己的飯碗。那么，技術(shù)員的地位就不可以提高了嗎？不是。提高地位靠什么，靠呼吁？同情？對(duì)抗？都沒(méi)有用。事物發(fā)展都有它內(nèi)在的規(guī)律，只有從根本上去解決決定技術(shù)員地位的東西。那就是提高技術(shù)的知識(shí)含量，提高技術(shù)的完成質(zhì)量。 三、醫(yī)生與技術(shù)的關(guān)系： 1、很多人會(huì)說(shuō)，技術(shù)員工作做的不好，和醫(yī)生沒(méi)什么關(guān)系，其實(shí)不然。最簡(jiǎn)單的如取材，如果醫(yī)生取材厚薄不均，組織就處理不好，HE切片和免疫組化質(zhì)量都會(huì)有影響。技術(shù)員片子做的不好，醫(yī)生可以退片，要求重切，這是我們技術(shù)員應(yīng)該做的；但是，如果醫(yī)生取材不好，技術(shù)員要退組織，大多數(shù)醫(yī)生是不會(huì)同意的。這里就存在一個(gè)不合理的現(xiàn)象。還有的醫(yī)生提出取材不好，技術(shù)員可以自己去修一下，我不同意這樣的做法，一是技術(shù)員有可能修去你需要的病變，這個(gè)責(zé)任誰(shuí)負(fù)，這是一種醫(yī)療事故，是對(duì)病人的不負(fù)責(zé)；二是作為醫(yī)生你應(yīng)該做好你自己的本職工作。 2、醫(yī)生工作和學(xué)習(xí)的態(tài)度，在很大程度上影響著技術(shù)員，醫(yī)生不喜歡學(xué)習(xí)，技術(shù)員一般也不會(huì)學(xué)習(xí)。前面我說(shuō)過(guò)新技術(shù)的應(yīng)用，會(huì)受到病理診斷水平和科研能力的制約。如果醫(yī)生什么都不懂，什么工作都不開(kāi)展，技術(shù)員的業(yè)務(wù)水平也無(wú)法提高。我就碰到有的主任自己不會(huì)看特染，不懂免疫組化，卻說(shuō)是技術(shù)員沒(méi)做好。真是比竇娥還冤，因?yàn)槟氵B申辯的地方都沒(méi)有，甚至有的還真以為自己就是這么差，在這樣的工作環(huán)境下，很多技術(shù)員會(huì)逐漸喪失了自信。 3、將就。很多醫(yī)生不管技術(shù)員切片做的多差，能將就的就將就，造就了技術(shù)員的惰性，我認(rèn)為這是對(duì)病人的不負(fù)責(zé)，對(duì)技術(shù)員的不負(fù)責(zé)，也是對(duì)自己不負(fù)責(zé)。 4、看不起技術(shù)。這樣的病理醫(yī)生其實(shí)很多，認(rèn)為技術(shù)員只是操作工，培養(yǎng)個(gè)2-3個(gè)月就可以做得很好（當(dāng)然這很大程度也是我們技術(shù)員自己造成的，技術(shù)水平越差，醫(yī)生就越看不起，你越看不起，我就越差，是一種惡性循環(huán)）。技術(shù)工作我認(rèn)為有點(diǎn)象燒菜的，每個(gè)家庭都會(huì)燒。但是同樣的配方，同樣的油、鹽、醬、醋、味精，每人做出的味道就是不一樣。做菜的也分將就型的、主婦型的、廚師型的、特級(jí)廚師型的。什么是廚師？廚師不僅對(duì)色、香、味、各種菜系、營(yíng)養(yǎng)的搭配有研究，找出存在的問(wèn)題和解決的方法，不斷地吸收新的知識(shí)，還要有創(chuàng)新的能力。目前我們大多數(shù)的技術(shù)員（包括我自己）只是涉及到病理技術(shù)的一小部分，只學(xué)了一點(diǎn)點(diǎn)皮毛，要學(xué)好技術(shù)，還有很長(zhǎng)的一段路要走。重視技術(shù)，提高技術(shù)水平，可以減少診斷的差錯(cuò)，最終受益的是我們的醫(yī)生和病人。 2、其他原因： 1）有科研能力的與沒(méi)科研能力的病理科之間的差異。 2）大醫(yī)院與小醫(yī)院之間的差異。 3）經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)與落后地區(qū)的差異。 如何解決這些問(wèn)題： 1、首先技術(shù)員要正確認(rèn)識(shí)自己，擺正自己的位置，要自尊，自強(qiáng)，自愛(ài)！增強(qiáng)技術(shù)員的自信心，要相信自己能做到，能做的最好。 2、多學(xué)習(xí)理論知識(shí)，多向同行學(xué)習(xí)，學(xué)會(huì)總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，學(xué)會(huì)理論與實(shí)際相結(jié)合，學(xué)會(huì)用腦干活。 3、科學(xué)的管理和規(guī)范化操作，是解決質(zhì)量問(wèn)題的關(guān)鍵。 病理技術(shù)很多是憑經(jīng)驗(yàn)工作，由于經(jīng)驗(yàn)的隨意性較大，導(dǎo)致質(zhì)量的不穩(wěn)定性。和國(guó)際接軌，是我們的奮斗目標(biāo)，在這背景下，中華病理學(xué)會(huì)提出了病理技術(shù)規(guī)范化操作。病理技術(shù)有很多小竅門(mén)，有的是在犧牲制片質(zhì)量的前提下發(fā)明的，使用者往往自己不知道。每個(gè)地方操作方法不同，導(dǎo)致制片質(zhì)量各不相同。 規(guī)范化操作是病理制片質(zhì)量的保證，而量化的管理增加了病理制片質(zhì)量的穩(wěn)定性。 所謂規(guī)范化，就是在操作過(guò)程中，對(duì)使用試劑種類(lèi)、pH值、濃度、溫度、時(shí)間以及操作的手法都有詳細(xì)的規(guī)定，盡可能的減少人為的影響，減少變量，減少影響制片質(zhì)量的條件。特別是在做分子技術(shù)時(shí)，更應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)則做。 所謂量化，就是把以前經(jīng)驗(yàn)的東西用量來(lái)判定。比如說(shuō)我們更換脫水試劑，一般都是要等組織不好切了才換，這樣總有幾天片子質(zhì)量不好；也有的是幾天到了就換，組織多時(shí)脫水液的水份就多，后面幾天可能組織就脫不好；組織少了脫水液倒了很浪費(fèi)，我們通過(guò)幾年的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)組織的量和試劑的更換時(shí)間有一定的規(guī)律，用量來(lái)控制脫水的更換時(shí)間更具科學(xué)性。還有蘇木素、依紅也是如此。 要想搞好制片質(zhì)量，各地必須建立質(zhì)控組織，通過(guò)技術(shù)交流和行政監(jiān)督的手段，促進(jìn)病理技術(shù)的發(fā)展，做好每一步。例如常規(guī)切片的注意事項(xiàng)： 1.取材 取材的好壞，直接影響切片的質(zhì)量。在一個(gè)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室，大部份的切片質(zhì)量問(wèn)題都是因?yàn)槿〔牟缓迷斐傻?。醫(yī)生在取材時(shí)，首先要有一把鋒利的取材刀，在切割組織時(shí)要避免取材刀來(lái)回拖拉，切取的組織塊厚薄要均勻，一般厚度以0.2 ～0.3cm為適，大塊癌組織、脂肪組織、肺組織、纖維性腫瘤、平滑肌瘤等致密的或試劑不易滲入的組織應(yīng)取薄一些；淋巴結(jié)應(yīng)修掉兩側(cè)球冠，并盡量剔除周?chē)闹窘M織。在取材中還應(yīng)十分注意組織內(nèi)是否有縫線或骨組織，如碰到不可避免的鈣化組織，應(yīng)與技術(shù)室講明，在切取纖維組織、肌肉組織、胃腸道時(shí)，應(yīng)注意纖維及肌肉的走向，取材時(shí)盡可能按與纖維平行走向切取為佳。小標(biāo)本取材時(shí)要注意包埋紙的質(zhì)量，盡可能選擇象桃花紙、包茶葉紙等透水性好的紙張，包時(shí)不要雙層、多層或折疊層數(shù)太多，也不要把過(guò)多的組織放在一起，影響脫水液的浸透。特別要注意新鮮組織取材，組織容易粘在包埋盒壁上，導(dǎo)致固定、脫水不佳。如果有可能，應(yīng)選擇剖開(kāi)固定24小時(shí)后再取材。 2 . 固定 固定是技術(shù)室工作的第一步，也是在整個(gè)制片過(guò)程中無(wú)法補(bǔ)救的一步。所謂“固定”，就是組織離體后，用各種辦法使其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量接近其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)、位置和除水以外的物質(zhì)的過(guò)程。固定的目的是為了防止組織細(xì)胞自溶與腐敗，防止細(xì)胞內(nèi)的酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解作用，使細(xì)胞內(nèi)的各種成分如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、酶類(lèi)轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結(jié)構(gòu)和生活時(shí)相仿。另外，組織固定后，均呈一定的硬化狀態(tài)，增加了組織的韌性，而且不易變形，有利于以后的組織處理。所以組織一旦離體必需及時(shí)固定，固定液的量應(yīng)為組織的5倍以上。固定的關(guān)鍵主要與固定的及時(shí)性、固定液的選擇、固定液的濃度、固定的溫度和時(shí)間有關(guān)。最常用的固定液為10％福爾馬林（甲醛）。福爾馬林滲透性強(qiáng)，固定均勻，組織收縮小，但經(jīng)酒精脫水后收縮較大。甲醛不能使白蛋白和核蛋白沉淀。甲醛通過(guò)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。由于10％福爾馬林受到福爾馬林的質(zhì)量、使用時(shí)的揮發(fā)和取材時(shí)帶入水分的影響，濃度容易被降低，導(dǎo)致組織固定不足；而高濃度的福爾馬林，降低了對(duì)組織的穿透性，形成周?chē)潭ê枚醒牍潭ú坏降默F(xiàn)象。所以可以適當(dāng)?shù)脑黾痈栺R林的濃度，以12％左右為佳。 pH7.0中性緩沖福爾馬林對(duì)大多數(shù)抗原有很好的保存作用，而非中性緩沖福爾馬林略差，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證明，二者有差異，但并不十分明顯，通過(guò)對(duì)抗原修復(fù)液、檢測(cè)系統(tǒng)和修復(fù)方法的不同選擇，可以縮小二者的差異。由于HE染色時(shí)細(xì)胞核的最佳著色點(diǎn)pH為3.5～4.5,中性福爾馬林對(duì)蘇木素染色有一定影響,細(xì)胞核容易發(fā)灰。而病理診斷，主要還是以HE切片為主，就常規(guī)HE規(guī)范化而言，用酸性福爾馬林比中性福爾馬林要好，每95毫升12％的福爾馬林液內(nèi)加入5毫升的冰醋酸。但從規(guī)范和全面角度出發(fā)，還是應(yīng)該使用中性緩沖福爾馬林。當(dāng)然如果根據(jù)常規(guī)切片、免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)的需要不同選用二種或二種以上不同的固定液分開(kāi)制片是最好的解決辦法。骨髓應(yīng)該選擇用Bouin液固定24-48小時(shí)，如果脫鈣不夠，可用10%鹽酸再脫2-4小時(shí)，然后流水沖洗4小時(shí)。送檢來(lái)的大器官應(yīng)及時(shí)切開(kāi)固定，大標(biāo)本取材后（2cm厚）固定時(shí)間需要6～12個(gè)小時(shí)，小標(biāo)本一般需要3～6個(gè)小時(shí)；當(dāng)室溫低18℃時(shí)，應(yīng)在37℃以下的溫箱內(nèi)加溫4～6個(gè)小時(shí)。 目前，環(huán)保固定液大部份是醇性固定液，對(duì)免疫組化結(jié)果有一定的影響，乳腺癌診治規(guī)范明確規(guī)定不能用醇性固定液，由于我們的診斷標(biāo)準(zhǔn)都是根據(jù)10%中性緩沖福爾馬林制定的，因此，我們應(yīng)該慎用。 3. 水洗 固定后應(yīng)該水洗（10～20分鐘），這一步通常被很多人所忽視，固定后不水洗，容易造成脫片和染色不鮮艷。也不利于蠟塊內(nèi)抗原的長(zhǎng)期保存。 4 .脫水 所謂脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來(lái)，以利于有機(jī)溶劑的滲入，這一過(guò)程稱為脫水。脫水是否徹底，直接關(guān)系到組織是否能充分透明。一般我們總認(rèn)為脫水主要跟高濃度酒精有關(guān)，而忽視了與低濃度的酒精關(guān)系，其實(shí)75-80%濃度的酒精具有極強(qiáng)的穿透力，在短時(shí)間內(nèi)可以置換出大量的水份，而高酒精容易使蛋白質(zhì)凝固，在組織的表面形成一層硬殼，使酒精難以滲透到組織塊中間去，導(dǎo)致組織脫水不佳；其實(shí)高濃度酒精里只需脫去從低濃度到高濃度之間的水份，如果脫水時(shí)加溫過(guò)高（超過(guò)35-50℃），使用丙酮等等，都容易導(dǎo)致組織收縮過(guò)度和組織發(fā)硬、發(fā)脆。組織脫水引起的組織發(fā)脆有三種原因：一種是初始脫水液濃度過(guò)高引起組織質(zhì)地發(fā)生改變；第二種是組織本身質(zhì)地有關(guān)，如小動(dòng)物肝臟，第三種是假脆（也是組織發(fā)脆最主要原因），是由于的脫水不足，組織在浸蠟時(shí)蠟無(wú)法滲透到組織中去，組織在高溫下“干烤”導(dǎo)致發(fā)硬、發(fā)脆，切片會(huì)出現(xiàn)粉粉的或一絲絲的現(xiàn)象，子宮肌瘤等較硬的組織還會(huì)一棱棱的現(xiàn)象，甚至?xí)麎K整塊往外崩；嚴(yán)重脫水不足的組織中間發(fā)軟，甚至還會(huì)有水。 脫水的關(guān)鍵是如何使低濃度的酒精脫水時(shí)間和高濃度的酒精脫水時(shí)間的正確搭配，低濃度的酒精可以使組織收縮減少，并使組織更好切，高濃度的酒精使組織脫水更徹底。一般情況下，標(biāo)本脫水時(shí)間（35℃）以75％酒精1.5小時(shí),85％酒精2小時(shí)、95％酒精（2道大）各1個(gè)半小時(shí)至2小時(shí)、純酒精（2道）各1個(gè)半小時(shí)至2小時(shí)。小標(biāo)本脫水時(shí)間與大標(biāo)本差異不大，一般沒(méi)必要分開(kāi)，小標(biāo)本發(fā)脆，往往是因?yàn)榧埌窕蛳嗷フ吃谝黄?，?dǎo)致組織脫水不徹底引起。如果由于時(shí)間關(guān)系，也可適當(dāng)相應(yīng)縮短。脫水時(shí)間長(zhǎng)短，與室溫高低有密切的相關(guān),同時(shí)也與組織的厚薄，組織類(lèi)型，組織固定的程度等條件都有關(guān)。我們?cè)趯?shí)踐中發(fā)現(xiàn)，室溫在12～15℃時(shí)，可作為一個(gè)臨界溫度范圍。當(dāng)室溫高于此溫度范圍時(shí)，組織容易脫水，可適當(dāng)縮短脫水時(shí)間；而室溫低于該溫度范圍時(shí)，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)脫水時(shí)間。從規(guī)范化角度出發(fā)，應(yīng)該盡可能的減少變量，也就是：溫度、濃度和作用時(shí)間。如果一年四季都在一個(gè)恒定的溫度下（35℃）最好，有條件的應(yīng)該買(mǎi)全封閉自動(dòng)脫水機(jī)。更換脫水液，應(yīng)以量為基礎(chǔ)，定量更換。根據(jù)我科經(jīng)驗(yàn)，如試劑用量為500ml，每500個(gè)蠟塊更換一次為宜。在更換脫水液時(shí)，不提倡全部試劑向前退的方法，因?yàn)榇朔ú荒鼙ＷC低濃度的酒精的濃度（往往會(huì)偏高），所以我們認(rèn)為85%的酒精不能退到75%的酒精里，95%的酒精不能退到85%的酒精里，無(wú)水酒精不能退到95%的酒精里，而第二道的95%的酒精可以退到第一道95%的酒精里，第二道無(wú)水酒精也可以退到第一道無(wú)水酒精里（如果純酒精要退到95%酒精里，可用比重計(jì)測(cè)量，加水或加純酒精）。要保證各梯度酒精的真正濃度。只有這樣才能做好每一批組織。常規(guī)切片脫水的原則就是在最短的時(shí)間內(nèi)，使組織脫水徹底，收縮度、硬度適中，切片舒展、好切。 5.透明 為了使石蠟?zāi)軌蚪氲浇M織塊內(nèi)，必須經(jīng)過(guò)一種既能與脫水劑混合，又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì)，這個(gè)過(guò)程稱透明。目前最好的透明劑是二甲苯。很多人認(rèn)為二甲苯極容易使組織發(fā)脆，這個(gè)觀點(diǎn)有點(diǎn)片面，在常溫下，如果不是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，二甲苯并不會(huì)引起組織發(fā)脆，相反會(huì)使某些組織結(jié)構(gòu)比較質(zhì)韌的組織（比如子宮肌瘤等）由于透明充分而變的更好切，但是當(dāng)二甲苯溫度超過(guò)一定范圍以后（45℃以上），才可能引起組織發(fā)脆。所以二甲苯透明應(yīng)該控制在室溫，（2道）各30-60分鐘為宜。 6. 浸蠟 組織透明后，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱為浸蠟。目的為了使石蠟滲透到組織中去。浸蠟溫度過(guò)高（超過(guò)60℃），在蠟內(nèi)加入二甲苯或由于透明時(shí)帶入石蠟的二甲苯過(guò)多，都會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)硬，還會(huì)使組織內(nèi)的抗原受到破壞；所以浸蠟用的石蠟熔點(diǎn)應(yīng)該在54-56℃左右（三道），時(shí)間：第一道：石蠟30分鐘；第二道：石蠟60分鐘；第三道：石蠟，90分鐘以上。浸蠟溫度控制在56～58℃左右。（第一道也可用硬脂酸石蠟1：3混合浸蠟，不僅可軟化組織，特別適用于比較韌、硬的組織，而且由于硬脂酸是弱酸性的，染色后核漿比比較鮮明，缺點(diǎn)是容易脫片，疏松組織在展片時(shí)容易散開(kāi)，所以要用后面幾道石蠟盡可能將硬脂酸洗凈。所以一般不要使用此法）。用開(kāi)放式的脫水機(jī)最好每天打開(kāi)第一道石蠟的蓋子，讓二甲苯揮發(fā)掉。浸蠟用的石蠟如有雜質(zhì)應(yīng)該過(guò)濾，以防吸入組織內(nèi)，造成切片刀刀口受損，或切片破碎和劃痕增多。 7.包埋 用包埋劑來(lái)支持組織的過(guò)程稱包埋。最常用的是石蠟包埋法。包埋的關(guān)鍵一是平整，二是方位。要求在包埋時(shí)，應(yīng)采用鑷子輕壓組織塊拱起部份，使之平貼于底部，通常采用組織的最大面包埋。囊壁、管腔組織應(yīng)豎直包埋。小塊多顆組織，應(yīng)盡量放在一起，并保證在一個(gè)平面上，蠟塊上下應(yīng)留有余蠟。包埋時(shí)還應(yīng)注意有無(wú)縫線，紙絮，如有一定要去除。胃黏膜活檢標(biāo)本，不能按一般的規(guī)律取最大包埋面，應(yīng)采取窄面豎起包埋。包埋的蠟更應(yīng)過(guò)濾，留有雜質(zhì)的石蠟，容易造成污染或刀口受損。蠟的熔點(diǎn)應(yīng)在56～58℃之間選擇，不提倡在冬天使用軟蠟。因?yàn)橛密浵灠竦南瀴K，到了夏天，會(huì)粘在一起，不利于資料的保存，而且即使在冬天，用硬蠟包埋的蠟塊也比用軟蠟包埋的蠟塊要好切。 8. 磨刀 要想切好一張切片，首先要有一把鋒利的切片刀。磨刀是從事切片技術(shù)人員的一項(xiàng)最基本技術(shù)，刀磨的好壞，直接關(guān)系到切片的質(zhì)量。磨刀的手法各人不同，但都要求用力均勻，使刀口和磨刀石全面接觸，兩手的用力點(diǎn)應(yīng)在刀口上，而不是在刀背上。切片刀應(yīng)用一次磨一次，每次僅需10～15分鐘，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的磨刀，容易把已經(jīng)磨出的鋒刃磨掉，檢查切片刀是否鋒利，用手試摸刀口的方法并不十分科學(xué)，不僅不能證明切片刀是否真正鋒利，而且容易損害刀口，最簡(jiǎn)單的辦法是每次磨好后拿一個(gè)蠟塊試切一下。每次磨好刀后，應(yīng)將磨刀石用蓋子蓋好，以防灰塵掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，會(huì)使切片刀產(chǎn)生許多細(xì)小的缺口?，F(xiàn)在很多單位都買(mǎi)了磨刀機(jī)，磨刀機(jī)用來(lái)開(kāi)刀鋒和磨缺口的確不錯(cuò)，但由于磨刀的角度和時(shí)間不易精確掌握，故效果并不理想。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，真正的鋒刃很難用機(jī)器磨出來(lái)。一次性刀片在很大程度上解決了這個(gè)問(wèn)題。如用一次性刀片，必須及時(shí)更換刀口。粗切的刀口和切片用的刀口最好分開(kāi)，這樣可以節(jié)約刀片，也可提高切片質(zhì)量。 9. 切片 切片前要把切片機(jī)上有關(guān)的螺旋擰緊，并調(diào)整好切片刀的角度。切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大約在15～30微米左右，質(zhì)地較硬的組織或較小的組織應(yīng)再薄一些，粗切致組織全部暴露后，才進(jìn)行細(xì)切。細(xì)切至組織塊表面均勻一致，無(wú)白點(diǎn)后，再把切出的蠟片放入溫水中。切片時(shí)要求用力均勻、柔和，搖速不易過(guò)快或過(guò)慢。過(guò)快會(huì)導(dǎo)致切片厚薄不均，切片難以展開(kāi)；過(guò)慢會(huì)使切片增厚。切片厚度一般為3～5微米。切片的要求是完整、薄、均勻。切下的片膜其大小形狀應(yīng)與組織塊一致，切片的不完整，常會(huì)將重要病變遺漏，導(dǎo)致誤診、漏診。在切片放蠟塊時(shí)，應(yīng)注意組織包埋的方向，組織的層次，纖維、肌肉等的走向應(yīng)與切片刀平行，較難切的部分應(yīng)放在上面，如皮膚的表皮，腫塊的包膜，胃腸道的漿膜等，這樣可以減少組織的斷裂現(xiàn)象。操作切片機(jī)時(shí)應(yīng)用力均勻，避免用力過(guò)重，減少機(jī)器的磨損。在使用毛筆展片時(shí)要防止筆絲進(jìn)入刀口，因?yàn)槊壳械揭桓P絲，就會(huì)增加一個(gè)缺口。切片厚度一般為3～5微米，有人認(rèn)為：只要切片機(jī)刻度標(biāo)著幾個(gè)微米，切出來(lái)的片子就是幾個(gè)微米。其實(shí)不然，當(dāng)切片刀不鋒利，或切片時(shí)速度不勻，或切的較慢時(shí)，切的片子都會(huì)變厚，只有在切片刀十分鋒利、切片勻速的情況下，才能真正保證其厚度。下面是切片時(shí)碰到的問(wèn)題的原因及可能處理的方法：(1)組織發(fā)脆：一般是脫水、透明、浸蠟時(shí)間太短、起始濃度過(guò)高，在切片時(shí)，刀要快，片子要切得薄，蠟塊不要太冰，可放在冰水里5-10分鐘再切片；也可邊切邊用嘴向蠟片吹氣，可能會(huì)好些，也可以在蠟塊上涂稀氨水；如果與組織本身質(zhì)地有關(guān)（如小動(dòng)物肝臟），蠟塊可采用不冰就切。（2)切片卷起，可能是刀不鋒利，或刀鋒在另一面，或刀角度過(guò)大，切片太厚等等。(3)蠟片彎曲：可能是刀鋒不均，切片刀未磨直，切片刀與蠟塊不平行。(4) 透明、浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高，并與組織本身質(zhì)地也有關(guān)(5)厚薄不均：可能是刀、刀座及蠟塊未夾緊，組織太硬，或切片機(jī)主軸太向前，或切片機(jī)已磨損。(6)切片出現(xiàn)裂痕：可能是刀有缺口，石蠟內(nèi)有雜質(zhì)，組織內(nèi)有鈣化、骨片或有線結(jié), 也可能會(huì)有棉紙纖維等。(7)切片不連片，切不下片，切片很厚，或者切片后蠟塊發(fā)白，內(nèi)陷：組織脫水不佳。補(bǔ)救辦法：可先將蠟塊溶解，取出組織，放入加熱水浴的丙酮內(nèi)（80℃），30～60分鐘，再進(jìn)行透明浸蠟包埋切片，也許會(huì)好一點(diǎn)。 切片機(jī)用完后必須每天清掃干凈，并用松節(jié)油或白油等把機(jī)器的表面和各關(guān)節(jié)擦拭干凈。要想保證機(jī)器的精確度和延長(zhǎng)機(jī)器的壽命，重點(diǎn)在于機(jī)器的保養(yǎng)，必須養(yǎng)成一個(gè)良好的工作習(xí)慣。 10. 展片與撈片 展片水溫應(yīng)在42℃至55℃之間，這主要和包埋蠟的熔點(diǎn)和蠟內(nèi)的添加劑有關(guān),水溫過(guò)高，會(huì)引起組織細(xì)胞散開(kāi)，水溫過(guò)低，切片皺摺無(wú)法攤平。包埋蠟中如有二甲苯，會(huì)造成蠟片迅速溶解。而用一次性刀片切的片子，一碰到熱水，片子上的皺摺就無(wú)法再展開(kāi)，這有二個(gè)方法可以解決：第一、可以在切片時(shí)邊切邊向蠟片吹氣，這樣的片子就會(huì)非常平整，放到熱水里就會(huì)自然展開(kāi)，比較方便快捷，但這樣的片子會(huì)略微厚一點(diǎn)；第二、在切完片子后，先把切片放入冷水，再將切片移到熱水，這樣的片子會(huì)較薄，皺摺、氣泡也少，是一個(gè)很好的方法，推薦使用。也有人選擇先放入酒精，如濃度過(guò)高，容易引起切片破碎，出現(xiàn)裂隙；像脂肪之類(lèi)細(xì)胞間粘附性較小的組織一碰到酒精就會(huì)散開(kāi)，故不作推薦。最后撈片時(shí)玻片要干凈，要選擇那些完整、無(wú)皺摺的切片，粘貼于玻片中1/3和下1/3的中間。 11. 烤片和脫蠟 烤片，一般在65℃的溫箱內(nèi)烤片0.5～1小時(shí)左右，溫度過(guò)高，會(huì)引起切片細(xì)胞收縮；時(shí)間太短(少于20分鐘)，容易造成脫片。脫蠟也相當(dāng)重要，如果脫蠟不干凈，切片不易著色或著色不勻，所以，脫蠟用的二甲苯要經(jīng)常更換，一般用3道二甲苯，每500ml液體，處理500張切片后更換一次為宜。當(dāng)室溫低于18℃時(shí)，必須將切片從溫箱拿出后立即放入二甲苯中脫蠟，或?qū)⒍妆椒湃霚叵鋬?nèi)預(yù)熱（37-60℃左右）脫蠟。然后經(jīng)高濃度的酒精到低濃度的酒精洗去二甲苯，至水。 12. 染色 染色的原理分物理作用和化學(xué)作用二種： 物理作用：分毛細(xì)現(xiàn)象，吸附作用和吸收作用，還有分子間的作用力。 化學(xué)作用：分化學(xué)物質(zhì)的特性基團(tuán)（酸性、堿性和兩性基團(tuán)）與染料的結(jié)合方式（離子鍵；共價(jià)鍵和氫鍵） 而染料根據(jù)來(lái)源可分： （1）、天然染料（胭脂紅、地衣紅、番紅花紅、靛青等） （2）、合成染料（亞硝基染料、硝基染料、偶氮染料、重氮鹽類(lèi)、醌亞胺染料、苯甲烷類(lèi)染料、口山 叮類(lèi)染料、蒽醌染料、噻唑類(lèi)染料、喹啉類(lèi)染料） （3）、無(wú)機(jī)化合物（硝酸銀、氯化金、碘、高錳酸鉀等） 根據(jù)染料的化學(xué)反應(yīng)可分： （1）、酸性染料：苦味酸，伊紅、酸性品紅、剛果紅等。酸性染料不是指其水溶液一定顯酸性，而是指有酸性助色團(tuán)與堿作用成鹽，其水溶液電離出的有色離子為陰離子。 （2）、堿性染料：蘇木素，中性紅，美藍(lán)、甲基綠等。堿性染料不是指其水溶液一定顯堿性，而是指有堿性助色團(tuán)與酸作用成鹽，其水溶液電離出的有色離子為陽(yáng)離子。 （3）、中性染料：是酸性染料和堿性染料混合后而成。如瑞氏染色的堿性染料亞甲藍(lán)和酸性染料伊紅混合。 蘇木素染色時(shí)間要根據(jù)染料的新舊、溫度、切片的類(lèi)型而定，一般為5－15分鐘。經(jīng)水略洗后，用鹽酸酒精分化是關(guān)鍵，分化程度必須用顯微鏡控制。分化水洗后，可用溫水或自來(lái)水藍(lán)化，并充分水洗（流水沖洗5分鐘以上），以防鹽酸殘留導(dǎo)致切片褪色。我們不提倡使用堿性溶液（釋氨水、肥皂水等）促藍(lán)，盡管藍(lán)化效果很好，但從實(shí)踐的結(jié)果來(lái)看，用堿性溶液促藍(lán)的切片不能長(zhǎng)期保存，容易褪色。最后入伊紅復(fù)染（5－20秒）。HE染色的關(guān)鍵在于深淺適度，對(duì)比鮮明，一般有經(jīng)驗(yàn)的，肉眼就能判斷，但偶而也會(huì)出現(xiàn)失誤，所以用顯微鏡控制是最保險(xiǎn)的方法。其關(guān)鍵的步驟在于蘇木素染好后的分化及藍(lán)化過(guò)程，在藍(lán)化結(jié)束后，應(yīng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞核著色是否合適，核結(jié)構(gòu)是否清晰，胞漿內(nèi)是否有殘留的蘇木素等等。染色理想的切片在顯微鏡下應(yīng)是：細(xì)胞核與細(xì)胞漿應(yīng)藍(lán)紅相映，鮮艷美麗；核漿對(duì)比明顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見(jiàn)。 染液的更換也應(yīng)該量化，蘇木素1500張/500ml，依紅3000張/500ml（根據(jù)配方不同，蘇木素和伊紅量會(huì)有所差異）。 13. 脫水和封片切片脫水應(yīng)從低濃度的酒精到高濃度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，純酒精2道，二甲苯2道。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水，但也容易使伊紅褪色，故脫水時(shí)間可短一點(diǎn)，每道1－3分鐘，純酒精每道5-10分鐘。為增加酒精與二甲苯的相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸－二甲苯液也有此效，但石碳酸是弱酸性液體，如不洗凈，可引起切片的褪色，不利于切片久存，故不作推薦。切片經(jīng)二甲苯透明后，用中性樹(shù)膠封固。為增加切片的透明度，防止細(xì)胞收縮、龜裂或切片出現(xiàn)黑色結(jié)晶樣小點(diǎn)，所以切片應(yīng)該二甲苯透明后濕封，嚴(yán)禁用溫箱烤干或電吹風(fēng)吹干后封片，這樣容易造成細(xì)胞收縮。封片時(shí)要防止口鼻呼出的氣體接觸到切片；在天氣較潮濕的日子里，不宜一次將多張切片取出待封，以免切片“還潮”，形成透明不佳,出現(xiàn)云霧狀水珠。脫水劑的更換也應(yīng)有一定的時(shí)間規(guī)定。一般是每500ml液體，處理500張切片后更換一次為宜。封片樹(shù)膠不能過(guò)稀，封片時(shí)樹(shù)膠要均勻充滿蓋玻片且樹(shù)膠不及外溢為佳。要將組織全部覆蓋，也不能有氣泡。但是，也應(yīng)該從關(guān)心技術(shù)員的身體健康出發(fā)，以人為本，建議有條件的病理科應(yīng)該購(gòu)買(mǎi)自動(dòng)封片機(jī)， 沒(méi)有條件的在封片時(shí)可以使用環(huán)保透明劑透明和環(huán)保樹(shù)膠封片，但效果沒(méi)有二甲苯透明的好。最后，粘貼標(biāo)簽，標(biāo)簽必須貼于玻片左側(cè)，編號(hào)書(shū)寫(xiě)清楚，最好能打印。 我希望在中華病理學(xué)會(huì)的倡導(dǎo)下，在各種組織的配合下，通過(guò)我們的努力，使中國(guó)的病理技術(shù)有一個(gè)質(zhì)的飛躍。 |
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