文章來源：中華神經(jīng)科雜志, 2024, 57(1): 5-9. 作者：焦可馨 趙重波
重癥肌無力（MG）是一種由自身抗體介導(dǎo)的累及神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫性疾病，致病性自身抗體的檢測(cè)對(duì)其診斷以及病情判斷至關(guān)重要。商業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)和醫(yī)院常用放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附法或細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)MG患者的血清抗體，但在敏感度和特異度方面存在不少問題，同時(shí)缺乏高級(jí)別循證醫(yī)學(xué)的直接比較研究。近期SCREAM研究的發(fā)布用中國人的數(shù)據(jù)證實(shí)了細(xì)胞免疫熒光法的優(yōu)勢(shì)，為MG實(shí)驗(yàn)室診斷的優(yōu)選推薦提供了Ⅰ級(jí)證據(jù)，填補(bǔ)了國內(nèi)外空白。然而，上述檢測(cè)方法所獲得的結(jié)果均難以用于患者的縱向比較，并不能作為關(guān)聯(lián)病情的最佳生物標(biāo)志物。文中同時(shí)結(jié)合近些年對(duì)MG致病性自身抗體的認(rèn)識(shí)進(jìn)展嘗試討論這個(gè)問題，并對(duì)未來的發(fā)展進(jìn)行展望。 重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種由自身抗體介導(dǎo)、影響神經(jīng)-肌肉接頭傳遞的自身免疫性疾病，臨床上以波動(dòng)性骨骼肌無力為主要特點(diǎn)。通過特定檢測(cè)手段鑒定自身致病性抗體對(duì)疾病的診斷至關(guān)重要，同時(shí)也為基于血清抗體分型的“個(gè)性化”治療策略提供了指導(dǎo)。在過去幾十年中，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和基于細(xì)胞底物的實(shí)驗(yàn)法（cell-based assay，CBA）用于檢測(cè)乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）和肌肉特異性酪氨酸激酶（muscle-specific tyrosine kinase，MuSK）抗體的診斷準(zhǔn)確性進(jìn)行了多項(xiàng)研究。然而，這些研究受到樣本量小、單中心和非盲法設(shè)計(jì)的限制，使其在診斷敏感度和特異度方面存在顯著的變異性。因此，關(guān)于檢測(cè)AChR和MuSK抗體的優(yōu)選診斷方法尚無統(tǒng)一共識(shí)。 近期，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院施福東教授團(tuán)隊(duì)牽頭中國多家中心進(jìn)行了一項(xiàng)多中心、雙盲、前瞻性隊(duì)列研究（the Specificity，Sensitivity and Clinical Correlation of CBA，CBA-TSA，RIPA and ELISA Assay in Detecting AChR and MuSK IgG，SCREAM），比較了固定法CBA、RIPA和ELISA在MG診斷中檢測(cè)AChR和MuSK抗體的敏感度和特異度，其成果發(fā)表在 The Lancet Regional Health-Western Pacific雜志上，為MG的致病性抗體檢測(cè)領(lǐng)域提供了高級(jí)別循證醫(yī)學(xué)證據(jù) ［ 1 ］ 。文中就MG血清致病性自身抗體的認(rèn)識(shí)進(jìn)展和診斷技術(shù)進(jìn)行評(píng)述。 一、MG致病性自身抗體的病理機(jī)制 人類的骨骼肌煙堿樣AChR受體有成人型（α2βδε）和胎兒型（α2βδγ）2種異構(gòu)體，當(dāng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿與受體結(jié)合后會(huì)引起鈉離子通道開放，引起能啟動(dòng)肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)的動(dòng)作電位。多數(shù)AChR的自身抗體為IgG1或IgG3亞型，與α1亞單位的胞外段相結(jié)合，主要通過3種不同的分子機(jī)制介導(dǎo)突觸后膜的病理損傷 ［ 2 , 3 ］ ：（1）激活補(bǔ)體介導(dǎo)的結(jié)構(gòu)損傷（激活補(bǔ)體型）：在患者的突觸后膜上可檢測(cè)到由自身抗體和補(bǔ)體組成的免疫復(fù)合物沉積，通過超微結(jié)構(gòu)觀察可見AChR丟失和突觸間隙擴(kuò)大，終板電位波幅下降。（2）阻斷AChR上的乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)（阻斷型）：一些AChR自身抗體可結(jié)合于乙酰膽堿的結(jié)合位點(diǎn)或附近，阻斷離子通道的開放。（3）對(duì)AChR表面進(jìn)行抗原調(diào)節(jié)（調(diào)節(jié)型）：IgG1和IgG3亞型的AChR自身抗體為二價(jià)，可以通過與受體交聯(lián)加速其內(nèi)吞和溶酶體降解，從而減少AChR的數(shù)量。補(bǔ)體激活和抗原調(diào)節(jié)機(jī)制還可使包括rapsyn、utrophin和Na +電壓門控通道在內(nèi)的AChR相關(guān)蛋白丟失，進(jìn)一步損害突觸后膜 ［ 2 ］ 。 MuSK是一種受體酪氨酸激酶，選擇性表達(dá)于神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜，與神經(jīng)源性聚集蛋白（neurogenic aggregin，Agrin）、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白4（low density lipoprotein-associated protein 4，LRP4）和對(duì)接蛋白7（docking protein 7，DOK7）形成Agrin-LRP4-MuSK-DOK7蛋白軸，對(duì)AChR在突觸后膜的聚集錨定以及維持膜穩(wěn)態(tài)等方面有重要作用。MuSK的自身抗體為IgG4亞型，不激活補(bǔ)體，主要通過與MuSK的N端免疫球蛋白樣1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻斷LRP4和MuSK的相互作用，導(dǎo)致MuSK的激活和磷酸化障礙，持續(xù)喪失MuSK信號(hào)會(huì)導(dǎo)致突觸后膜AChR簇集的解聚和突觸解體，損害神經(jīng)肌肉接頭的傳遞。IgG4可與其他特異性IgG4發(fā)生Fab臂交換，由此產(chǎn)生雙特異性的IgG4分子，以單價(jià)方式與其抗原相互作用 ［ 3 ］ ，降低其結(jié)合能力。當(dāng)予以靜脈注射人體免疫球蛋白治療時(shí)，外源性IgG不容易與IgG4形成抗原抗體復(fù)合物而將其中和清除，因此療效欠佳。然而，為何具有較弱抗原結(jié)合能力的單價(jià)IgG4會(huì)對(duì)MuSK產(chǎn)生明顯影響，其具體機(jī)制尚未明了。 LRP4同屬于Agrin-LRP4-MuSK-DOK7蛋白軸，與Agrin結(jié)合后形成二聚體，進(jìn)一步激活MuSK。LRP4的自身抗體主要為IgG1型，體外研究表明能阻礙Agrin和LRP4之間的相互作用 ［ 4 , 5 ］ ，抑制Agrin誘導(dǎo)的小鼠成肌細(xì)胞肌管中的AChR聚集 ［ 5 , 6 ］ 。小鼠身體局部注射來自大鼠的LRP4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，可出現(xiàn)肌無力癥狀并在注射局部發(fā)現(xiàn)AChR簇集的碎片化，同時(shí)伴有微小終板電位和終板電位變小 ［ 7 ］ 。此外，通過從LRP4主動(dòng)免疫的兔子中提取IgG并被動(dòng)轉(zhuǎn)移給小鼠，能“復(fù)刻”出MG的臨床表型和AChR簇集的病理改變 ［ 3 ］ 。然而，迄今為止尚無將LRP4抗體陽性的MG（LRP4-MG）患者的自身抗體進(jìn)行被動(dòng)轉(zhuǎn)移的研究報(bào)道。
二、致病性自身抗體作為生物標(biāo)志的重要性 由于MG的自身致病性抗體不斷被鑒定發(fā)現(xiàn)，其診斷已進(jìn)入基于血清學(xué)抗體分類的“精準(zhǔn)診斷”時(shí)代。不同致病性抗體的MG亞型在臨床表型和治療反應(yīng)上有所差別，對(duì)診斷和治療決策有重要影響。約85%的全身型和50%~60%的眼肌型MG患者血清AChR抗體陽性，AChR抗體陰性的患者中有30%~60%存在MuSK抗體陽性，抗體雙陰性的MG患者中約有19%存在LRP4抗體陽性 ［ 8 , 9 ］ 。然而，LRP4抗體的特異度不如前兩者，分別可在8%AChR抗體陽性的MG（AChR-MG）、15%MuSK抗體陽性的MG（MuSK-MG）以及4%的其他神經(jīng)免疫病患者血清中檢測(cè)到 ［ 10 ］ 。此外，有研究結(jié)果表明10%~23%的肌萎縮側(cè)索硬化患者血清中也能檢測(cè)到LRP4抗體 ［ 11 ］ 。鑒于LRP4抗體的特異度不夠高，盡管有體外和動(dòng)物研究的致病性證據(jù)，近些年的REGAIN、ADAPT、RAISE以及MyCarinG等臨床試驗(yàn)均未納入LRP4-MG作為研究對(duì)象 ［ 12 , 13 , 14 , 15 ］ 。 AChR-MG可伴有胸腺瘤或胸腺增生，早發(fā)型以女性多見，晚發(fā)型以男性多見，對(duì)免疫治療反應(yīng)不一，對(duì)伴有胸腺瘤者實(shí)施手術(shù)治療為A級(jí)推薦 ［ 16 ］ ，對(duì)非胸腺瘤的全身型患者也可考慮實(shí)施胸腺切除治療以改善病情并減少合并使用糖皮質(zhì)激素的劑量 ［ 17 ］ 。此外，近幾年針對(duì)補(bǔ)體C5和新生兒Fc受體（neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）的生物靶向治療均以AChR-MG為對(duì)象獲得了明顯療效 ［ 12 , 13 , 14 , 15 ］ 。MuSK-MG發(fā)病年齡不定，胸腺正常，單純眼肌型少見，以延髓肌和中軸肌受累為主，對(duì)傳統(tǒng)免疫治療和靜脈注射人體免疫球蛋白反應(yīng)欠佳，但對(duì)B細(xì)胞刪除治療反應(yīng)較好 ［ 18 ］ 。從LRP4所在Agrin-LRP4- MuSK-DOK7蛋白軸的位置而言，理論上推導(dǎo)LRP4抗體如果有致病性，其所致的臨床表型應(yīng)該與MuSK接近，但事實(shí)并非如此。LRP4-MG患者發(fā)病年齡不定，女性多見，胸腺正常，總體癥狀相對(duì)較輕，一般認(rèn)為其對(duì)免疫治療反應(yīng)較好 ［ 19 ］ 。因此，基于自身致病性抗體類型有助于對(duì)患者制定相對(duì)個(gè)性化的治療策略。 一直以來，國內(nèi)外學(xué)者曾嘗試將AChR抗體的水平作為疾病嚴(yán)重程度或預(yù)測(cè)干預(yù)治療效果的標(biāo)志，但一直未能如愿。雖然眼肌型MG患者的AChR抗體滴度通常低于全身型患者，但血清抗體滴度與MG的嚴(yán)重程度之間沒有絕對(duì)的相關(guān)性 ［ 4 ］ 。Sanders等 ［ 20 ］ 的研究結(jié)果表明，AChR抗體水平的下降與臨床病情的改善只有弱相關(guān)性，其陽性預(yù)測(cè)值為83%，陰性預(yù)測(cè)值僅為59%。 然而，也有一些間接證據(jù)表明抗體水平與疾病進(jìn)展、嚴(yán)重程度和治療反應(yīng)相關(guān)。Peeler等 ［ 21 ］ 通過一項(xiàng)基于眼肌型MG患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)展為全身型MG者的平均AChR抗體水平顯著高于未發(fā)展為全身型者，但僅為趨勢(shì)，不能界定出一個(gè)預(yù)測(cè)值。Kojima等 ［ 22 ］ 采用調(diào)整后的AChR抗體水平的每日降低率（RR-AChR Ab，% /d）來預(yù)測(cè)MG患者的治療預(yù)后，其計(jì)算公式=（治療前AChR 抗體水平-治療后AChR抗體水平） /治療前AChR抗體水平 /從治療開始至重新檢測(cè)AChR抗體水平之間的天數(shù)×100%。該研究結(jié)果顯示，RR-AChR Ab高的患者與治療后1年的良好預(yù)后有關(guān)。近期的一項(xiàng)盲法回顧性隊(duì)列研究也表明AChR抗體血清水平的升高和降低分別與MG患者臨床狀況的嚴(yán)重和輕微相關(guān)，對(duì)MG患者的隨訪有價(jià)值 ［ 23 ］ 。 AChR抗體水平不能反映病情的原因較為復(fù)雜且未完全明了，主要推測(cè)與以下因素有關(guān)：（1）同一例患者體內(nèi)可能存在發(fā)揮前述3種致病機(jī)制的多克隆抗體，多個(gè)AChR特異性克隆的組合可以協(xié)同作用，增強(qiáng)致病效應(yīng) ［ 24 ］ 。（2）AChR亞單位和抗原表位是多樣的，可位于突觸后膜和離子通道的不同部位，針對(duì)不同抗原位點(diǎn)的自身抗體所產(chǎn)生的致病性可能會(huì)有所差別，因而檢測(cè)到的抗體水平不能與致病性相匹配 ［ 25 ］ 。（3）單克隆的AChR抗體可能同時(shí)具有前述3種致病機(jī)制 ［ 25 ］ ，這使得患者血清中抗體的致病性更加難以定量。（4）存在非致病性AChR抗體。Maddison等 ［ 26 ］ 在5例非MG患者血清中通過放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）檢測(cè)到AChR抗體，但改用CBA檢測(cè)結(jié)果卻為陰性，推測(cè)這些通過RIA檢測(cè)到的抗體僅針對(duì)AChR的胞內(nèi)段抗原，沒有致病性。在臨床實(shí)踐中，血清中AChR自身抗體的檢測(cè)不能對(duì)激活補(bǔ)體型、調(diào)節(jié)型和阻斷型3種致病機(jī)制的抗體克隆進(jìn)行甄別，也不能對(duì)多個(gè)克隆間的相互疊加作用予以定量，所以無法真實(shí)反映抗體的總體致病性。 由此可見，對(duì)AChR抗體的定性和致病性定量不應(yīng)該再是傳統(tǒng)的單一維度，而應(yīng)同時(shí)考慮抗體的輕鏈/重鏈 CDR3基因序列、抗原表位和結(jié)合模式，建立一個(gè)綜合參數(shù)，或許才能真正作為預(yù)測(cè)患者病情的生物標(biāo)志物。
三、血清致病性自身抗體的檢測(cè)方法及其局限性 目前MG血清自身抗體的檢測(cè)方法包括RIPA、ELISA和CBA。RIPA在各類研究中最為常用，以檢測(cè)AChR抗體為例，是使用等量表達(dá)胚胎型和成人型AChR的人肌細(xì)胞系TE671細(xì)胞提取物或人類截肢肌肉提取物作為抗原，通過 125碘-α-銀環(huán)蛇毒素（ 125I-α-BuTx）標(biāo)記AChR，用羊抗人IgG血清沉淀抗原抗體復(fù)合物 ［ 27 ］ 。RIPA的特異度高達(dá)99%，全身型MG的敏感度為85%，眼肌型為50% ［ 28 , 29 ］ 。ELISA在臨床檢測(cè)中常用，使用高度選擇性與AChR結(jié)合的α-銀環(huán)蛇毒素包被固相載體，加入含AChR的骨骼肌提取物，再測(cè)定待測(cè)血清中的抗AChR抗體。這種方法簡便易行且可以避免應(yīng)用放射性物質(zhì)，便于推廣，但其敏感度和特異度均不及RIPA ［ 27 ］ 。 CBA是更為靈敏的一種檢測(cè)方法，它以人類胚胎腎活細(xì)胞為檢測(cè)對(duì)象，能更好地模擬AChR的自然狀態(tài)，具有非常高的特異性，可以檢測(cè)到親和力較低的抗體。在RIPA測(cè)定血清AChR抗體為陰性的患者中，通過CBA可以檢測(cè)出30%~60%的陽性 ［ 30 ］ 。 RIPA對(duì)MuSK抗體檢測(cè)的特異度接近100%，但在不同研究中的敏感度差異較大。CBA檢測(cè)的特異度達(dá)100%，而敏感度較RIPA高8%~9%，ELISA的敏感度低于RIPA和CBA ［ 30 ］ 。 CBA的檢測(cè)結(jié)果為滴度，不適合用于定量分析。RIPA和ELISA可以產(chǎn)生具體的nmol/L數(shù)值（摩爾術(shù)語），但由于前述致病性抗體的復(fù)雜性，其結(jié)果也很難適用于縱向比較。Sanders等 ［ 20 ］ 不建議將商業(yè)試劑盒檢測(cè)的AChR抗體水平作為MG改善的生物標(biāo)志物。此外，上述3種方法可能由于檢測(cè)體系中抗原的選擇、檢測(cè)極限的限制、致病抗體的復(fù)雜性、檢測(cè)方法批次間的異質(zhì)性以及抗體的非特異交叉反應(yīng)等，會(huì)在一定程度上影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性 ［ 31 ］ 。 SCREAM研究通過多中心、雙盲研究結(jié)果表明，在2 043例MG患者的血清樣本中，CBA、RIPA和ELISA檢測(cè)AChR抗體的敏感度分別為72.3%、64.1%和62.7%，特異度分別為97.8%、97.8%和94.8%；檢測(cè)MuSK抗體的敏感度分別為2.9%、2.4%和2.6%，特異度分別為100%、100%和99.1%。ELISA更容易產(chǎn)生假陽性，在敏感度方面也無優(yōu)勢(shì)。而相較于所謂“金標(biāo)準(zhǔn)”的RIPA，固定法CBA可以將AChR抗體檢測(cè)的陽性率提升8.2%，在RIPA檢測(cè)陰性的患者中，仍有27.5%的患者AChR抗體為陽性，證實(shí)了固定法CBA在檢測(cè)AChR抗體和MuSK抗體方面具有更好的可靠性和有效性，為MG患者的血清學(xué)檢測(cè)推薦提供了Ⅰ級(jí)證據(jù)。
四、結(jié)語 MG在繼藥物治療進(jìn)入循證醫(yī)學(xué)時(shí)代之后，以SCREAM研究的發(fā)表作為標(biāo)志，實(shí)驗(yàn)室抗體診斷也進(jìn)入了循證醫(yī)學(xué)時(shí)代，中國學(xué)者在其中不斷發(fā)力，正在發(fā)揮越來越多的積極作用。然而，鑒于致病性抗體本身的復(fù)雜性，僅在診斷上獲得優(yōu)化的方法學(xué)指導(dǎo)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，未來如何重新定義致病性抗體的“多維度”和開發(fā)新的、能真實(shí)反映致病性的檢測(cè)方法仍任重而道遠(yuǎn)。
參考文獻(xiàn)略
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