重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種由自身抗體介導(dǎo)的、累及神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜、導(dǎo)致NMJ信號(hào)傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病^[1]，主要臨床表現(xiàn)為部分或全身骨骼肌無力和易疲勞性。全球發(fā)病率為每年(0.3～2.8)/10萬^[2]，各個(gè)年齡段均可發(fā)病。聚集蛋白－低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4－肌肉特異性酪氨酸激酶(Agrin－LRP4－MuSK)信號(hào)通路誘導(dǎo)的乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)簇聚是維持NMJ信號(hào)傳遞的關(guān)鍵因素，任何一個(gè)環(huán)節(jié)受損都可能引起突觸后膜AChR數(shù)量減少和功能障礙，導(dǎo)致肌無力發(fā)生^[3,4]。其中AChR抗體(AChR－ab)、肌肉特異性酪氨酸激酶抗體(MuSK－ab)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4抗體(LRP4－ab)是MG重要的特異性致病抗體^[5,6]。皮動(dòng)蛋白(cortactin)位于Agrin－LRP4－MuSK信號(hào)通路下游，通過促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞支架的形成從而使突觸后膜AChR簇集^[7]。國(guó)外有研究報(bào)道，在某些其他自身免疫性疾病(如多發(fā)性肌炎、免疫介導(dǎo)的壞死性肌病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)患者血清中可檢測(cè)出抗皮動(dòng)蛋白抗體，皮動(dòng)蛋白可能是自身免疫性疾病的一種新的靶抗原^[8]。而皮動(dòng)蛋白是NMJ傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵的信號(hào)蛋白，MG患者血清中是否存在抗皮動(dòng)蛋白抗體、其與MG的相關(guān)性等問題尚不明確。因此，我們以重組純化人皮動(dòng)蛋白作為抗原，采用Western印跡法、ELISA檢測(cè)MG患者血清抗皮動(dòng)蛋白抗體，同時(shí)配對(duì)檢測(cè)了患者AChR－ab、MuSK－ab水平，旨在探討抗皮動(dòng)蛋白抗體在MG中的臨床意義。

資料和方法

一、研究對(duì)象

100例MG患者(MG組)來自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科MG數(shù)據(jù)庫(kù)(2015年6月至2017年6月門診及住院患者)。其中男性40例，女性60例，年齡(42.9±16.5)歲；漢族90例，少數(shù)民族10例，后者包含苗族4例、黎族2例、布依族1例、水族1例、壯族1例、維吾爾族1例。MG的診斷依據(jù)'中國(guó)重癥肌無力診斷和治療指南2015'中的診斷標(biāo)準(zhǔn)^[9]。將隨訪中最終被診斷為其他疾病，如Lambert－Eaton肌無力綜合征、先天性肌無力綜合征、其他原因?qū)е碌难奂÷楸砸约安煌鈪⑴c本研究的患者均予以剔除。根據(jù)改良Osserman分型，100例MG患者中Ⅰ型42例、ⅡA型20例、ⅡB型31例、Ⅲ型4例、Ⅳ型3例，無Ⅴ型患者。對(duì)照組包括40例其他神經(jīng)免疫疾病(other neuroimmune diseases，OND組；包含多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎等)以及40名健康對(duì)照(健康對(duì)照組，均來自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢門診)。40例OND患者中男性18例，女性22例，年齡(40.5±11.2)歲。40名健康對(duì)照中男性16名，女性24名，年齡(39.5±9.8)歲。對(duì)照組的年齡、性別以及民族均與病例組相匹配。3組研究對(duì)象在性別(χ²＝0.321，P＝0.852)和年齡(F＝0.979，P＝0.378)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)所有入組者均于應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療之前進(jìn)行標(biāo)本采集。

本研究為病例對(duì)照研究，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院道德倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批號(hào)：2016倫審第14號(hào))，所有受試者均口頭同意或簽署書面知情同意書。

二、研究方法

1．標(biāo)本采集：

對(duì)所有受試者均于清晨空腹時(shí)使用真空采血促凝管采集靜脈血5 ml，3 000 r/min離心15 min后分離血清，放入－80 ℃冰箱儲(chǔ)存以備批量檢測(cè)。

2．Western印跡法檢測(cè)抗皮動(dòng)蛋白抗體：

將重組純化人皮動(dòng)蛋白(20 μg，美國(guó)OriGene公司)加入上樣緩沖液，95 ℃煮沸使蛋白充分變性。每孔取0.24 μg蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)。恒流200 mA，2 h轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用封閉液室溫封閉1 h。按1∶40比例稀釋待測(cè)血清，與PVDF膜進(jìn)行孵育(4 ℃過夜)。陽性對(duì)照采用兔抗皮動(dòng)蛋白抗體(武漢三鷹公司)按1∶1 000比例稀釋，空白對(duì)照用一抗稀釋液代替一抗，與PVDF膜孵育(4 ℃過夜)。三羥甲基氨基甲烷－鹽酸－吐溫－20緩沖液(TBST)洗膜后加入1∶3 000稀釋的兔抗人辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G(IgG－HRP)室溫孵育1 h(陽性對(duì)照使用羊抗兔IgG－HRP孵育)，TBST洗膜后采用電化學(xué)發(fā)光試劑顯色。重組純化人皮動(dòng)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為57 300，故每次檢測(cè)以印跡膜上顯示相對(duì)分子質(zhì)量在55 000～70 000間的條帶者為陽性。

3．ELISA檢測(cè)抗皮動(dòng)蛋白抗體：

將重組純化人皮動(dòng)蛋白用ELISA包被緩沖液稀釋為1 μg/ml，以每孔100 μl包被至微孔板中，4 ℃孵育過夜。用磷酸鹽－吐溫－20緩沖液洗板3次，每孔加入5%牛血清白蛋白(BSA)溶液200 μl，37 ℃孵育1 h。洗板3次后，將待測(cè)血清按1∶100稀釋，以每孔100 μl加樣于微孔板中，37 ℃孵育1 h。棄去孔內(nèi)液體，洗板3次，將兔抗人IgG－HRP按1∶1 000稀釋，每孔100 μl，37 ℃溫育40 min。同上洗板，每孔加3，3′，5，5′－四甲基聯(lián)苯二胺顯色液100 μl，37 ℃顯色20 min，用2 mol/L H₂SO₄ 100 μl終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值，每一標(biāo)本均設(shè)復(fù)孔，取平均值。以健康對(duì)照組平均吸光度值＋3倍標(biāo)準(zhǔn)差為界值C，大于者為陽性。

4．AChR－ab、MuSK－ab測(cè)定：

對(duì)這兩種抗體的檢測(cè)均采用間接ELISA法，按試劑盒(CBS－EN027201HU，武漢華美生物公司)說明書進(jìn)行。終止反應(yīng)后在Synergy H4型酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)上450 nm處測(cè)定吸光度值。結(jié)果判斷：判斷值＝2.1×陰性孔平均吸光度值(陰性對(duì)照吸光度值<>

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，3組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)(百分比)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P<>

結(jié)果

一、AChR－ab、MuSK－ab檢測(cè)結(jié)果

100例MG患者中36例(36%)AChR－ab陽性，5例(5%)MuSK－ab陽性，59例(59%)血清學(xué)陰性。

二、抗皮動(dòng)蛋白抗體Western印跡檢測(cè)結(jié)果

100例MG患者中9例(9%)抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性(圖1)，其中4例抗皮動(dòng)蛋白抗體合并AChR－ab陽性，余5例為抗皮動(dòng)蛋白抗體單陽性且均在血清學(xué)陰性患者中檢出，未檢測(cè)出抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性合并MuSK－ab陽性患者。健康對(duì)照組及OND組抗皮動(dòng)蛋白抗體均為陰性。

1：抗皮動(dòng)蛋白抗體陰性(健康對(duì)照組血清)；2：空白對(duì)照(一抗稀釋液代替一抗)；3：陽性對(duì)照(兔多克隆抗皮動(dòng)蛋白抗體)；4：其他神經(jīng)免疫疾病組；5～13：抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性(患者血清)

圖1 3組研究對(duì)象血清抗皮動(dòng)蛋白抗體Western印跡檢測(cè)結(jié)果

三、抗皮動(dòng)蛋白抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

C值為0.242，MG組13例血清吸光度值高于C值(包含Western印跡法檢出的9例)，OND組1例高于C值(圖2)。

MG：重癥肌無力，OND：其他神經(jīng)免疫疾病。C為健康對(duì)照組平均吸光度值＋3倍標(biāo)準(zhǔn)差，高于C值為陽性

圖2 3組血清抗皮動(dòng)蛋白抗體　ELISA檢測(cè)結(jié)果(吸光度值，450 nm)

四、抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性MG臨床特點(diǎn)

兩種檢測(cè)方法結(jié)果均為陽性的標(biāo)本有9例。9例抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性患者中，6例男性，3例女性，發(fā)病年齡17～59歲；7例為早發(fā)型(發(fā)病年齡<50歲)，2例為晚發(fā)型(發(fā)病年齡>50歲)；病程(從發(fā)病至被納入研究)<6個(gè)月6例，12～24個(gè)月1例，>24個(gè)月2例。1例女性患者經(jīng)胸腺切除術(shù)后病理證實(shí)為胸腺增生；1例男性患者經(jīng)胸部CT提示為胸腺瘤；2例男性患者經(jīng)胸部CT提示為胸腺未完全退化，余5例患者無胸腺異常。5例抗皮動(dòng)蛋白抗體單陽性MG患者中有3例為Ⅰ型，臨床表現(xiàn)均為眼瞼下垂伴復(fù)視；1例為ⅡIA型，主要受累肌群為眼外肌和四肢?。?例為ⅡB型，主要受累肌群為眼外肌和延髓肌。4例抗皮動(dòng)蛋白抗體合并AChR－ab陽性患者中，3例為ⅡB型，眼外肌、四肢肌、延髓肌均受累；1例為Ⅳ型，眼外肌、四肢肌、延髓肌、呼吸肌全部相繼受累。對(duì)5例患者給予糖皮質(zhì)激素治療，3例患者給予糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療，1例患者僅給予膽堿酯酶抑制劑治療。隨訪確認(rèn)7例患者達(dá)到美國(guó)重癥肌無力協(xié)會(huì)(MGFA)工作組^[10]干預(yù)后狀態(tài)(post－intervention status, PIS)的藥物維持緩解，1例達(dá)到完全持久緩解，1例失訪(表1)。

討論

近年來，由于對(duì)NMJ蛋白復(fù)合體了解的不斷深入，對(duì)多靶點(diǎn)抗體的發(fā)現(xiàn)逐漸加深了人們對(duì)MG的認(rèn)識(shí)。MG是一種具有高度異質(zhì)性的疾病，以Agrin－LRP4－MuSK信號(hào)通路中主要功能分子為抗原的抗體，如AChR－ab、MuSK－ab、LRP4－ab，被證實(shí)與MG發(fā)病、胸腺改變、藥物反應(yīng)、預(yù)后等有關(guān)，并各自具有不同特點(diǎn)。它們分別表征了具有不同免疫致病機(jī)制和臨床特征的MG疾病亞型^[11]，在輔助診斷的同時(shí)指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療。約80%MG患者血清可檢測(cè)到AChR－ab^[12]，1%～10%MG患者血清可檢測(cè)到MuSK－ab^[12]，4%～18.7%雙陰性(AChR－ab和MuSK－ab均為陰性)的MG患者血清中可檢測(cè)到LRP4－ab^[13,14]。此外，尚有10% MG患者血清經(jīng)過反復(fù)檢測(cè)后上述3種抗體仍為陰性，目前對(duì)這類患者臨床特征的描述尚不統(tǒng)一，故認(rèn)為其可能是另一個(gè)異質(zhì)分組^[15]，血清陰性的原因除了抗體親和力過低或檢測(cè)手段敏感度不高外，極有可能是血清中還存在其他不為人知的新型抗體。

皮動(dòng)蛋白是由位于染色體11q13區(qū)上的CTTN基因(也稱ESM1基因)所編碼的一種單體蛋白，最初研究發(fā)現(xiàn)其是致癌性酪氨酸激酶v－Src的作用底物，隨后發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞皮層，與肌動(dòng)蛋白(actin)纖維結(jié)合后促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，故命名為皮動(dòng)蛋白^[16]。皮動(dòng)蛋白主要通過磷酸化修飾進(jìn)行活化，在細(xì)胞內(nèi)吞、樹突棘生長(zhǎng)及神經(jīng)元突觸形成等細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用^[16]。在骨骼肌細(xì)胞中，皮動(dòng)蛋白的酪氨酸磷酸化可被聚集蛋白增強(qiáng)，其在Agrin－LRP4－MuSK復(fù)合體下游被活化后通過激活微絲相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合及突觸后膜上的AChR簇形成^[7]。Gallardo等^[17]利用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)在血清學(xué)陰性MG患者的血清中檢測(cè)出皮動(dòng)蛋白，認(rèn)為其可能是MG的一種新的靶抗原，隨后在250例MG患者血清中檢出28例抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性(11.2%)^[18]。國(guó)內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道。目前對(duì)于抗皮動(dòng)蛋白抗體如何導(dǎo)致肌無力的機(jī)制尚不清楚，其對(duì)MG是否具有致病性仍需探討。但Madhavan等^[7]報(bào)道在C2C12小鼠成肌細(xì)胞中敲減皮動(dòng)蛋白后，聚集蛋白誘導(dǎo)的AChR簇集形成受到抑制，AChR簇的穩(wěn)定性也減弱。因此，抗皮動(dòng)蛋白抗體可能通過干擾Agrin－LRP4－MuSK信號(hào)通路使運(yùn)動(dòng)終板上AChR簇?cái)?shù)量減少而導(dǎo)致肌無力，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

我們檢測(cè)了我國(guó)西南地區(qū)100例MG患者和40例OND患者、40名健康體檢者血清抗皮動(dòng)蛋白抗體水平，Western印跡結(jié)果顯示，MG組陽性率為9%，而OND組和健康對(duì)照組均為陰性。59例血清學(xué)陰性MG患者中，有5例抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性。ELISA結(jié)果與Western印跡結(jié)果基本一致，但陽性例數(shù)略多，可能與兩種檢測(cè)方法的敏感度、特異度差異及陽性判定標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，故最終視兩種檢測(cè)方法結(jié)果均為陽性的病例為陽性病例。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性患者的發(fā)病年齡較輕(中位年齡34.9歲)，且不伴胸腺瘤^[18]。我們的研究結(jié)果也得到了相似的結(jié)論，9例抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性患者的中位發(fā)病年齡為34歲，且其中早發(fā)型的發(fā)生比例為7/9。此外，總共有4例患者伴發(fā)了胸腺異常，分別為1例胸腺增生、2例胸腺未完全退化，這3例患者均為抗皮動(dòng)蛋白抗體單陽性；另有1例胸腺瘤患者血清檢測(cè)結(jié)果為抗皮動(dòng)蛋白抗體合并AChR－ab陽性，可能與胸腺瘤相關(guān)型MG患者幾乎均伴有AChR－ab陽性的特點(diǎn)有關(guān)。

進(jìn)一步分析臨床資料發(fā)現(xiàn)，5例抗皮動(dòng)蛋白抗體單陽性MG患者中，4例以眼外肌無力或輕度的全身型MG起病，余1例雖以眼外肌無力起病，但在住院治療初出現(xiàn)咀嚼無力，經(jīng)疲勞試驗(yàn)等證實(shí)為延髓肌受累進(jìn)而診斷為ⅡB型，這與文獻(xiàn)報(bào)道的抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性患者通常無延髓肌受累不一致^[18]?？赡艽嬖谝韵聨c(diǎn)原因：(1)本次研究對(duì)象均為亞裔，由于地域或種族因素，在免疫學(xué)特性方面與歐美人群往往有所差異，導(dǎo)致受累肌群的選擇性不同；(2)研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)的差異：國(guó)外相關(guān)研究對(duì)受試者在采集標(biāo)本前是否使用過具有免疫抑制效應(yīng)的藥物無嚴(yán)格要求，若包括曾接受過免疫治療的患者，可能因疾病病程改變而影響隨訪觀察結(jié)果。

此外，本研究檢出的9例抗皮動(dòng)蛋白抗體陽性MG患者中，有4例抗皮動(dòng)蛋白抗體合并AChR－ab陽性，無抗皮動(dòng)蛋白抗體合并MuSK－ab陽性病例，結(jié)果同既往文獻(xiàn)報(bào)道^[17,18]。一直以來，人們普遍認(rèn)為AChR－Ab、MuSK－ab、LRP4－ab等MG的主要致病抗體各自單獨(dú)存在于MG患者血清中，不會(huì)并存。但Ohta等^[19]發(fā)現(xiàn)在AChR－ab陽性MG患者中有10.5%MuSK－ab陽性；Higuchi等^[20]在AChR－ab陰性血清中檢出LRP4－ab的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)3例LRP4－ab陽性患者合并MuSK－ab陽性；Cordts等^[21]發(fā)現(xiàn)7%的AChR－Ab陽性血清中可檢出LRP4－ab^[21]。由此可見，MG的多種抗體可同時(shí)并存，提示其自身免疫反應(yīng)并不局限于某種單一抗原，NMJ處各功能分子均有可能同時(shí)作為靶抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。目前認(rèn)為此類現(xiàn)象是抗原表位擴(kuò)展所致。表位擴(kuò)展是指在自身免疫疾病中，免疫系統(tǒng)可不斷擴(kuò)大所識(shí)別的自身抗原表位的范圍，使更多自身抗原遭受免疫攻擊(包括隱蔽表位)，導(dǎo)致疾病逐漸加重并遷延不愈^[22]。引起表位擴(kuò)展的機(jī)制主要有分子模擬作用、超抗原樣的作用、T－B細(xì)胞間的協(xié)同作用、遺傳因素等。我們檢出的抗皮動(dòng)蛋白抗體合并AChR－Ab陽性病例，可能因?yàn)槠?dòng)蛋白與AChR間發(fā)生了表位擴(kuò)展所致。進(jìn)一步對(duì)此4例患者臨床資料進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，3例ⅡB型患者均以眼外肌、四肢肌無力起病，隨后因累及延髓肌而就診。1例Ⅳ型患者10幾年前以眼外肌、四肢肌無力起病，隨后延髓肌、呼吸肌相繼受累。上述患者在病程中均表現(xiàn)為最廣程度的多肌群受累，臨床癥狀較重。由于此前大量臨床研究發(fā)現(xiàn)MG患者中疾病的嚴(yán)重程度與AChR－ab的滴度并不相關(guān)，故我們猜想在AChR－ab陽性的全身型MG患者中，若同時(shí)檢出抗皮動(dòng)蛋白抗體，可能預(yù)示著患者會(huì)面臨多肌群逐漸受累和病情加重的可能。

綜上所述，抗皮動(dòng)蛋白抗體可能是MG的一種新抗體，可為進(jìn)一步探討MG的發(fā)病機(jī)制提供線索，對(duì)MG的篩查診斷和預(yù)后的評(píng)估具有一定參考價(jià)值。但由于本研究樣本量較小，抗皮動(dòng)蛋白抗體與MG的關(guān)系仍需大樣本多中心的研究，以得出更為翔實(shí)的研究結(jié)果。