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今天課題師就為大家?guī)砹艘黄菀讖?fù)現(xiàn)的中醫(yī)藥方向的國自然思路文章，該文章的創(chuàng)新點(diǎn)是結(jié)合了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)+體內(nèi)體外驗(yàn)證方式進(jìn)行機(jī)制研究，內(nèi)容完整，研究思路明確，采用網(wǎng)藥分析三部曲（藥物-疾病靶點(diǎn)交集、PPI網(wǎng)絡(luò)、GO/KEGG通路分析）引出研究內(nèi)容，而且結(jié)合臨床標(biāo)志物指標(biāo)以及組織病理，qPCR，免疫組化，免疫熒光等技術(shù)豐富實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，充分展現(xiàn)了生物信息學(xué)作為工具所發(fā)揮的作用。寶子們抓緊學(xué)起來~

l題目：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究腎康注射液通過Keap1/Nrf2/Ho-1信號(hào)通路治療糖尿病腎病的機(jī)制

l雜志：Phytomedicine

l影響因子：IF=7.9

l發(fā)表時(shí)間：2023年9月

研究背景

糖尿?。―M）的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，目前全球約有5.37億糖尿病患者。糖尿病腎?。―KD）是糖尿病的常見并發(fā)癥，在T2DM人群中的患病率約為20%~40%，并且超過40%的終末期腎病患者是由DKD引發(fā)的。目前尚無特定的DKD藥物。

中醫(yī)（TCM）的辨證論治的個(gè)體化方法在臨床治療DKD中得到了廣泛應(yīng)用，并取得了良好的療效。然而，中醫(yī)藥防治DKD的作用機(jī)理及應(yīng)用仍需深入研究。腎康注射液（SKI）是一種中藥注射液，能顯著降低DKD患者24小時(shí)尿蛋白定量，保護(hù)腎功能，延緩DKD進(jìn)展。

因此，本研究采用動(dòng)物模型和細(xì)胞損傷模型，研究SKI對(duì)腎臟的保護(hù)作用，以及Keap1/Nrf2/Ho-1信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。    

研究方法

(1)通過TCMSP篩選SKI藥物靶點(diǎn)，通過GenGards、OMIM、Drugbank、TTD和Disgenet數(shù)據(jù)庫篩選DKD靶點(diǎn)，并對(duì)兩者交集進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，通過GO和KEGG進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

(2)隨機(jī)將40只SD大鼠分為對(duì)照組10只和模型組30只。模型組喂食高糖高脂飲食8周后，通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（35 mg/kg）構(gòu)建DKD模型。按體重，將模型動(dòng)物隨機(jī)分為三組：模型驗(yàn)證組8只，厄貝沙坦（每日25 mg/kg）組8只，SKI組8只（5 ml/kg）。對(duì)照組和模型驗(yàn)證組灌胃去離子水。觀察大鼠的一般情況，測(cè)量其體重，記錄24小時(shí)的尿量。干預(yù)16周后，收集血清檢測(cè)尿素、Scr、血脂以及氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化指標(biāo)；

(3)使用透射電子顯微鏡、HE和Mallory染色觀察腎組織的病理形態(tài)。

(4)免疫組化和RT-PCR用于檢測(cè)大鼠腎組織中Keap1、Nrf2、Ho-1、Gpx4蛋白和mRNA的表達(dá)。

(5)體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，并分為：對(duì)照組、AGEs（200 μg/ml）組和AGEs + SKI組。細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，使用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活性，并使用熒光探針檢測(cè)ROS。

(6)免疫熒光檢測(cè)Gpx4的表達(dá)，Western Blot用于檢測(cè)Keap1、Nrf2、Ho-1和Gpx4。

主要結(jié)果

1. 網(wǎng)絡(luò)藥理靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，鑒定了280個(gè)SKI靶點(diǎn)；從五個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫中獲得了1197個(gè)DKD疾病靶點(diǎn)，取交集后最終得到118個(gè)重疊靶點(diǎn)。PPI分析獲得NOS3、PTGS2、CASP3、CCL2、CXCL8、HIF1A、AKT1等核心靶點(diǎn)。在“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中，槲皮素、山奈酚和木犀草素的自由度最高，提示它們可能是SKI治療DKD的核心活性成分。    

GO/KEGG功能富集分析顯示，SKI預(yù)防和治療DKD的機(jī)制可能與AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化等通路有關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)，作者推測(cè)SKI可能是通過影響氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)AGEs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，預(yù)防DKD腎損傷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測(cè)，作者針對(duì)經(jīng)典的keap1/Nrf2/Ho-1信號(hào)通路進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理靶點(diǎn)預(yù)測(cè)    

2. SKI對(duì)DKD大鼠體重、24小時(shí)尿蛋白、腎功能和血脂的影響

在高糖高脂飲食+腹腔注射鏈脲佐菌素后對(duì)DKD大鼠進(jìn)行造模。造模成功后每4周對(duì)大鼠稱重，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，其余三組體重逐漸降低；與模型組相比，雖然治療組的體重最初也緩慢下降，但從給藥后的第8周開始逐漸恢復(fù)。

與對(duì)照組比較，DKD模型組大鼠24h尿蛋白水平、血清Scr和Urea含量升高，而兩個(gè)給藥組24h尿蛋白升高率均較低；與模型組相比，IRB組和SKI組的24小時(shí)尿蛋白水平顯著降低，SKI組和IRB組的組間差異不顯著。

模型組大鼠血清TC、TG、LDL水平顯著升高。與模型組相比，SKI組的TC、TG和LDL顯著降低；IRB組的TC顯著降低，但TG和LDL無顯著差異。

圖2 SKI對(duì)DKD大鼠體重、24小時(shí)尿蛋白、腎功能和血脂的影響    

3. SKI對(duì)DKD大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響

HE染色顯示，對(duì)照組大鼠的腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠的腎組織出現(xiàn)腎小球肥大、系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生、腎小管上皮細(xì)胞空泡變化、蛋白管型栓塞及腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤等病理改變；IRB組和SKI組的病理情況有所改善。

Mallory染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠的腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)保持正常；而模型組大鼠腎組織中部分區(qū)域腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化；經(jīng)IRB和SKI治療后，與模型組相比，腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的程度也相應(yīng)減輕。

透射電鏡觀察顯示，對(duì)照組大鼠足細(xì)胞的基底膜及足突正常；DKD大鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變；IRB組和SKI組大鼠腎小球病理改變均有不同程度的改善。

圖3 SKI對(duì)DKD大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響

4. SKI對(duì)腎組織keap1、nrf2、ho-1和gpx4 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的影響    

電泳結(jié)果顯示，模型驗(yàn)證組大鼠Keap1的表達(dá)顯著增加，而Irb組和SKI組的表達(dá)顯著降低；對(duì)照組Nrf2和Ho-1mRNA表達(dá)較低，DKD大鼠腎組織中Nrf2和Ho-1 mRNA的表達(dá)有輕微增加的趨勢(shì)，而SKI組Nrf2、Ho-1的表達(dá)顯著增加。模型驗(yàn)證組Gpx4 mRNA的表達(dá)下降，SKI干預(yù)后Gpx4 mRNA表達(dá)顯著增加。與模型驗(yàn)證組相比，Irb組Nrf2、Ho-1和Gpx4mRNA表達(dá)無顯著差異。

免疫組化顯示，模型驗(yàn)證組中，Ho-1和Keap1蛋白的表達(dá)水平較低，Ho-1蛋白的表達(dá)增加，而Keap1蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著增加；與模型驗(yàn)證組相比，SKI組中Ho-1蛋白表達(dá)顯著增加，而Keap1蛋白表達(dá)顯著降低；與對(duì)照組相比，模型驗(yàn)證組中Nrf2和Gpx4顯著降低，而SKI組Nrf2、Gpx4蛋白表達(dá)顯著升高。

圖4 SKI對(duì)腎組織keap1、nrf2、ho-1和gpx4 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的影響

5. SKI可顯著增強(qiáng)HK-2細(xì)胞活力

作者進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn)以確定最佳的SKI濃度，結(jié)果表明4％的SKI濃度最佳，用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，與AGEs模型組相比，SKI可顯著增強(qiáng)HK-2細(xì)胞活力。

通過觀察HK-2細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與AGEs模型組相比，SKI能夠誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞形態(tài)的改善。

DCFH-DA熒光探針染色結(jié)果顯示，對(duì)照組ROS含量處于較低水平，AGEs刺激后HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高，SKI可顯著降低AGEs誘導(dǎo)的ROS升高。    

圖5 SKI可顯著增強(qiáng)HK-2細(xì)胞活力

6. SKI對(duì)AGEs損傷的HK-2細(xì)胞keap1/Nrf2/Ho-1信號(hào)通路的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組中的HK-2細(xì)胞中Gpx4蛋白顯示出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，而經(jīng)過AGEs刺激后，Gpx4的熒光信號(hào)明顯減弱，而SKI的干預(yù)可顯著增加Gpx4的熒光信號(hào)強(qiáng)度。    

Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AGEs組的Keap1蛋白表達(dá)顯著增加，然而AGEs+SKI組的蛋白表達(dá)降低，AGEs組中的Ho-1蛋白表達(dá)增加，而AGEs+SKI組中的蛋白表達(dá)顯著增加。AGEs組中的Nrf2和Gpx4蛋白表達(dá)顯著降低，而AGEs+SKI組中的Nrf2和Gpx4蛋白表達(dá)顯著增加。

圖6 SKI對(duì)AGEs損傷的HK-2細(xì)胞keap1/Nrf2/Ho-1信號(hào)通路的影響

文章小結(jié)

本研究巧妙地結(jié)合了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，從整體到局部，從宏觀到微觀，全面深入地探討了SKI對(duì)DKD的作用。不僅為DKD的治療提供了新的可能，更為中醫(yī)的現(xiàn)代化研究開辟了新的道路。而且，這種干濕結(jié)合的研究方法很容易復(fù)現(xiàn)，充分的展現(xiàn)了生物信息學(xué)作為工具所發(fā)揮的作用。Ps：想復(fù)現(xiàn)這種思路或者定制更多創(chuàng)新性思路歡迎直接掃碼戳課題師哦~課題師為您定制化服務(wù)！