離子交換層析是目前功能最強(qiáng)大，應(yīng)用最廣泛的層析方式。隨著科技的發(fā)展進(jìn)步，Cytiva的離子交換填料也在不斷推陳出新，面對(duì)名目繁多的產(chǎn)品，到底該如何快速選擇適合自己的填料呢？

本篇將教大家如何識(shí)他們的本質(zhì)，快速鎖定合適的產(chǎn)品。

離子交換填料的選擇，一般遵循以下四個(gè)步驟

離子交換的原理

離子交換層析是根據(jù)樣品在特定 pH 值的 buffer 中所帶電荷的差異，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。樣品所處 buffer 的 pH 值低于其等電點(diǎn) pI 時(shí)，樣品帶正電，可以與陽(yáng)離子交換填料上帶負(fù)電的配基結(jié)合；所處 buffer 的 pH 值高于其等電點(diǎn) pI 時(shí)，樣品帶負(fù)電，可以與陰離子交換填料上帶正電的配基結(jié)合。

對(duì)某種樣品而言，buffer 的 pH 值與分離方式和效果的關(guān)系可通過下圖來直觀地感受：

因此對(duì)某種樣品而言，其適合的離子交換方式與所用的 buffer 的 pH 值息息相關(guān)。

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確定離子交換方式

樣品一般在中性 pH 值的環(huán)境中保持較好的活性，在進(jìn)行離子交換層析時(shí)，所用 buffer 的 pH 值需偏離樣品等電點(diǎn) 1 個(gè) pH 值以上。在交換方式的確定環(huán)節(jié)，常規(guī)選擇目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合到填料上，而雜質(zhì)流穿的模式，洗脫時(shí)收集目標(biāo)物。但也可以選擇目標(biāo)物質(zhì)為不結(jié)合填料的流穿模式，使雜質(zhì)結(jié)合到填料上，同樣可以達(dá)到目標(biāo)物質(zhì)與雜質(zhì)分離的目的。

所用 buffer pH 值高于樣品等電點(diǎn)時(shí)，樣品帶負(fù)電，一般用陰離子交換的方式進(jìn)行物質(zhì)的分離；所用 buffer 的 pH 值低于樣品的等電點(diǎn)時(shí)，樣品帶正電，一般用陽(yáng)離子交換的方式進(jìn)行物質(zhì)的分離。

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選擇配基

離子交換填料由基架和配基組成，填料的性質(zhì)主要由配基決定。目前Cytiva的離子交換填料上偶聯(lián)的配基一共有 6 種。

1. 陽(yáng)離子交換配基：SP（強(qiáng)陽(yáng)）、S（強(qiáng)陽(yáng)）、CM（弱陽(yáng)）；
2. 陰離子交換配基：Q（強(qiáng)陰）、DEAE（弱陰）、ANX（弱陰）。

離子交換填料的配基類型

注：一般首選強(qiáng)的離子交換配基，比如 Q，SP 等。如果樣品和待分離物等電點(diǎn)差異較小，可以選擇弱的離子交換配基，這樣在洗脫電導(dǎo)發(fā)生改變的時(shí)候，樣品與填料的結(jié)合力會(huì)發(fā)生比較明顯的改變，從而可以更好地分離結(jié)合力（帶電量）差異不明顯的物質(zhì)。

03

選擇基架

基架的主要差別在于填料粒徑大小，從而提供流速和分辨率的差異。離子交換填料基架包括以下三種：

交聯(lián)瓊脂糖基架：

• Sepharose 4FF：4% 的交聯(lián)瓊脂糖，提高分子量大于 650KDa 蛋白的結(jié)合載量；
• Sepharose XL：6% 的交聯(lián)瓊脂糖加葡聚糖鏈形成基架，配基偶聯(lián)在葡聚糖鏈上，載量提高；
• Sepharose Big Beads：粒徑 100-300um，用于捕獲階段粗樣品的提取，尤其適合比較粘稠的樣品。

高流速瓊脂糖基架：

• 由高度交聯(lián)的高流速瓊脂糖作為基架，表面為線狀葡聚糖鏈，剛性更強(qiáng)，傳質(zhì)速度更快。配基結(jié)合在線狀葡聚糖鏈上，因此擁有比傳統(tǒng) Sepharose 填料高出一倍的動(dòng)態(tài)載量，需要的保留時(shí)間大大縮短（圖 A）。Capto 在高流速時(shí)仍然可以保持較低的背景壓，因此可以使用更高的工作流速（圖 B）。

多模式離子交換填料：除了以上普通的離子交換填料外，Cytiva還推出了多模式離子交換填料。這類填料有兩種配基—弱陽(yáng)離子配基 MMC 和強(qiáng)陰離子配基 adhere，分別偶聯(lián)到粒徑為 75μm 和 40μm 的基架上，其中 40μm 的 ImpRes 系列分辨率更高。多模式填料結(jié)構(gòu)和可提供的作用力如下：

Capto MMC & Capto MMC ImpRes：

• 多模式弱陽(yáng)離子交換填料，具有離子、疏水、嗜硫親和和氫鍵作用等多種作用力。其疏水作用力使該填料在高電導(dǎo)情況下仍能保持理想的動(dòng)態(tài)載量，尤其適合用于需高電導(dǎo)上樣的大體積樣品的捕獲。

Capto adhere & Capto Adhere ImpRes：

• 多模式強(qiáng)陰離子填料，高特異性的 Adhere 配基能一步將內(nèi)毒素、DNA、聚集體、protein A、HCP 去除，使得抗體純化兩步法平臺(tái)工藝的實(shí)現(xiàn)成為可能。

至此，離子交換填料家族成員全部集齊，

其陣容如下：

04

根據(jù)純化步驟選擇合適的填料

因填料耐受的最大流速不同，分辨率和載量均有差異，同時(shí)樣品體積和純度在各純化步驟中千差萬(wàn)別，需要結(jié)合具體的純化步驟選擇合適的填料。

1) 捕獲

快速富集目的蛋白，將其從大量的雜質(zhì)或關(guān)鍵污染物如蛋白酶和糖苷酶中分離出來，載量和速度是該步驟的首要考慮因素。該步驟可以使用的離子交換填料類型是 Sepharose FF、Capto、Sepharose XL、Sepharose Big Beads。如果純化的樣品在 mg 級(jí)別且后期沒有放大需求，可以用 SOURCE 和 Sepharose HP 填料。

2) 中度純化

去除蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等明顯的雜質(zhì)，重點(diǎn)考慮載量和分辨率?？捎锰盍项愋停篠epharose HP、Capto ImpAct、Capto ImpRes、SOURCE 15 、SOURCE 30、Sepharose FF。如果純化的樣品在 mg 級(jí)別且后期沒有放大需求，可以用 MonoBeads。

3) 精純

去除痕量雜質(zhì)，如異構(gòu)體、核酸、病毒和內(nèi)毒素等，使目的樣品達(dá)到應(yīng)用級(jí)別，在這個(gè)環(huán)節(jié)中分辨率最重要。這個(gè)步驟可用填料：MonoBeads、SOURCE 15&SOURCE 30、Capto ImpAct、Capto ImpRes和 Capto Hires。

理清以上思路后可以根據(jù)樣品體積、穩(wěn)定性等，結(jié)合填料載量選出合適的填料及產(chǎn)品類型。

注意事項(xiàng)

選好產(chǎn)品后，在實(shí)際的使用中還需要注意以下幾個(gè)方面：

1. 上樣前需將樣品置換到平衡緩沖液中，在樣品體積相對(duì)柱體積來說較大時(shí)，這一點(diǎn)尤其重要；
2. 柱子載量和要達(dá)到的分辨率決定上樣量。如果想達(dá)到最好的分辨率，建議上樣量為柱子載量的 30%；
3. 實(shí)際載量受樣品大小和形狀的影響，同時(shí)填料孔徑，流速，樣品濃度，pH/蛋白帶電性、離子強(qiáng)度等均會(huì)影響載量；
4. 添加合適的去垢劑：添加離子型去垢劑時(shí)，應(yīng)避免加入的去垢劑與填料配基結(jié)合而影響填料的結(jié)合載量。