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導(dǎo)語(yǔ) 溫馨提示，視頻長(zhǎng)約6分鐘，建議在WiFi環(huán)境下觀看 SDS-Page電泳主要利用聚丙烯酰胺的分子篩效應(yīng)分離蛋白質(zhì)和核酸，SDS-PAG蛋白質(zhì)電泳分析可從蛋白質(zhì)亞基分子量的大小就分離蛋白質(zhì)。 幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所有條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并進(jìn)可能減少其相互間的聚集，最常用的就是SDS-PAGE電泳技術(shù)，關(guān)于大家在此過(guò)程中經(jīng)常遇到的問(wèn)題進(jìn)行一些討論： Q：SDS-PAGE電泳的基本原理? A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基硫酸鈉)，SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響? A：在SDS-page不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9;而電泳緩沖液使用的Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低;而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。 所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。 Q：樣品如何處理? A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 1、還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來(lái)分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過(guò)量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100μl樣品緩沖液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。 3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來(lái)使用。 Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用? A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān); 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris-HCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹; TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固; 十二烷基硫酸鈉(SDS)：陽(yáng)離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 Q：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑? A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)》P82-103。 Q：“微笑”(兩邊翹起中間凹下)形帶原因? A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 Q：“皺眉”(兩邊向下中間鼓起)形帶原因? A：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象? A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。 處理辦法：加樣前離心;選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制;降低凝膠濃度。 Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象? A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。 處理辦法：加樣前離心;加適量樣品促溶劑。 Q：什么是“鬼帶”，如何處理? A：“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端(有時(shí)在濃縮膠中)的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見(jiàn)其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑;或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。 Q：為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用? A：我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。 處理辦法：更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。 Q：為什么電泳的條帶很粗? A：電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事，主要是未濃縮好的原因。 處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度;保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7);適當(dāng)降低電壓; Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢? A：這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒(méi)有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反;b.外槽液過(guò)少;c.電泳槽底部的絕緣體未去掉(比如倒膠用的橡膠皮)。 處理辦法：電泳槽正確裝配即可。 Q：濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳有影響嗎? A：這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對(duì)電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過(guò)猛所致;后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 蛋白樣品，SDS-PAGE loading buffer，PBS，Tris-Hcl (PH 8.8)， Tris-Hcl (PH 6.8) ，30%丙烯酰胺，10%SDS，10%過(guò)硫酸，5×SDS-PAGE電泳緩沖液，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，脫色液。 一、凝膠配置 1．分離膠的配制
（1）找出配套的膠板，用擦鏡紙擦干凈，并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏； （2）若膠板不漏水，就進(jìn)行分離膠的配制。依次將水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨加到干凈的小燒杯中，混勻（1mm的膠板，一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%，但濃度也要視情況而定。蛋白越小，膠的濃度越大）； （3）將膠板中的水倒掉，并用濾紙吸干水分（不要將濾紙塞到膠板底部）； （4）小燒杯中再加入TEMED，混勻。（TEMED可使膠凝固，所以最后加）； （5）灌膠：混勻的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下，防止產(chǎn)生氣泡； （6）用水將分離膠壓平（用水灌滿，同時(shí)加水時(shí)要緩慢加入，防止把膠吹起）。 2．濃縮膠的配制
（1）待分離膠與水中間形成明顯的橫線，即分離膠凝固。隨后進(jìn)行濃縮膠的配制，依次將水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl（PH 6.8）、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨加到干凈的小燒杯中； （2）將分離膠上層的水倒掉，并用濾紙吸干水分（盡量不要把濾紙插入）； （3）小燒杯中再加入TEMED，混勻； （4）灌膠。然后插入梳子； （5）把制膠器倒過(guò)來(lái)，膠仍然不會(huì)往外流，或可以明顯看出梳子中兩個(gè)齒之間的膠面明顯凹下去，說(shuō)明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內(nèi)，并在電泳槽內(nèi)加入SDS-PAGE電泳緩沖液，把膠浸泡一段時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)越好（防止梳子與膠相連，或膠因濕度不夠而萎縮）； （6）點(diǎn)樣時(shí)，再把梳子拔出來(lái)，拔時(shí)動(dòng)作要輕，防止膠齒被拔斷。 二、SDS-PAGE電泳 1、調(diào)膠：拔掉SDS膠上的梳子，并用小針調(diào)整齒的位置（使它們都平行）。 2、點(diǎn)樣：用20μL的小槍頭，吸煮過(guò)的樣品10μL，對(duì)準(zhǔn)膠孔點(diǎn)樣，注意不要把樣品點(diǎn)在外面。使用適當(dāng)?shù)姆肿恿康鞍譵arker。 3、電泳：電泳儀正負(fù)極接好，打開(kāi)電源。濃縮膠：電壓 low 100V 分離膠：電壓 high 150V。 4、卸膠：等膠內(nèi)的所有的藍(lán)色都跑出去，電泳停止，一般時(shí)間為1-2小時(shí)左右。把膠板從電泳儀上卸下，用刀片把膠板撬開(kāi)，膠的濃縮膠部分割除； 5、染色：放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中進(jìn)行常溫過(guò)夜染色； 5、脫色：將過(guò)夜染色的SDS-PAGE膠放入脫色液中進(jìn)行脫色，直到背景發(fā)白。 一、3×SDS-PAGE loading buffer的配制
1、將除BPB以外的藥品完全溶解。SDS常溫下很難溶解，可以在37℃水浴溶解。完全溶解后，再加入BPB，進(jìn)行溶解； 2、把溶好的buffer分裝到1.5ml的離心管中，1ml/管，常溫放置； 3、使用前，每管加入30μL巰基乙醇。 注意事項(xiàng)：巰基乙醇為危險(xiǎn)品，加入的過(guò)程在通風(fēng)櫥中完成，并且?guī)Ш檬痔住?/p> 二、10×PBS的配制
1、用去離子水將以上藥品進(jìn)行溶解；（溶解的非常慢，可能需要過(guò)夜） 2、調(diào)PH值到7.2，用0.4μm的濾膜過(guò)濾。常溫保存； 3、工作時(shí)用的是1×PBS。 三、1.5M Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制
1、用200ml去離子水將Tris溶解。 2、用濃鹽酸調(diào)PH值到8.8。 3、調(diào)好PH的Tris-Hcl定容到250ml。 4、0.4μm的濾膜過(guò)濾，常溫保存。 注意事項(xiàng)：Tris的緩沖能力很強(qiáng)，調(diào)PH值時(shí)，費(fèi)些時(shí)間，但不要調(diào)過(guò)。 四、1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制
1、用200ml去離子水將Tris溶解； 2、用濃鹽酸調(diào)PH值到6.8； 3、調(diào)好PH的Tris-Hcl定容到250ml； 4、0.4μm的濾膜過(guò)濾，常溫保存。 五、30%丙烯酰胺的配制
1、把藥品用去離子水溶解后定容到250ml； 2、用濾紙過(guò)濾，放在棕色瓶子中，4℃保存。 注意事項(xiàng)：兩種藥品有毒性，配制過(guò)程要帶手套和口罩。 六、10%SDS的配制 1．1g SDS加入10ml去離子水進(jìn)行溶解； 2．分裝到1.5ml離心管中，-20℃保存。 七、10%過(guò)硫酸銨的配制 1．1g 過(guò)硫酸銨加入10ml去離子水進(jìn)行溶解。 2．分裝到1.5ml離心管中，-20℃保存。 八、5×SDS-PAGE電泳緩沖液的配制
將以上藥品用去離子水溶解后定容到1L，常溫保存。工作時(shí)用的是1×SDS-PAGE電泳緩沖液。 九、考馬斯亮藍(lán)R-250染色液的配制 1、往1g考馬斯亮藍(lán)R-250中加入250ml異丙醇，在磁力攪拌器上攪拌六小時(shí)以上； 2、加入650ml去離子水，磁力攪拌器攪拌過(guò)夜； 3、再加入100ml冰醋酸進(jìn)行溶解，磁力攪拌器攪拌； 4、在通風(fēng)櫥內(nèi)用濾紙進(jìn)行過(guò)濾。常溫保存。染色液只能反復(fù)用兩次。 注意事項(xiàng)：在磁力攪拌器上攪拌時(shí)，要把容器封口。 十、脫色液的配制
常溫保存。 |
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來(lái)自： ccchengphd > 《mAb》
