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在學習過程中，我們經(jīng)常會遇到各種PCR字眼，什么qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR，好多同學看的頭暈眼花也沒弄明白這幾種PCR有什么區(qū)別，那你呢？你了解PCR這個大家族嗎？還在傻傻分不清嗎？PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是一種體外擴增特定DNA片段的分子生物學技術。PCR技術自問世以來，在生物科學領域、分子診斷領域、親子鑒定、法醫(yī)鑒定以及犯罪調(diào)查等方面發(fā)揮了巨大作用，是迄今為止最為重要的技術之一。經(jīng)過演化和革新，PCR技術已經(jīng)發(fā)展了三代：普通PCR技術、實時熒光定量PCR技術（qPCR）以及數(shù)字PCR（dPCR）技術。圖1 PCR儀器的發(fā)展歷程（Lee NY., 2018）PCR的基本原理與DNA的體內(nèi)復制相類似，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火和延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)高溫（95℃左右）加熱一定時間后，使其解離成單鏈，以便它與引物結(jié)合；②模板DNA與引物的退火（復性）：將溫度降至55℃左右時，引物與模板DNA單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合；③引物的延伸：再將溫度調(diào)至72℃左右（DNA聚合酶最適反應溫度），DNA模板和引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，按堿基配對與半保留復制原理，沿著磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。這樣經(jīng)變性、退火和延伸重復若干個循環(huán)后，就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。圖2 PCR的基本反應步驟（圖片源自：Wikipedia）普通PCR即一代PCR，使用普通PCR擴增儀擴增靶基因，并通過瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行定性分析。2.實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）實時熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR擴增反應體系中加入熒光染料或者熒光基團，在整個PCR過程中通過收集熒光信號實時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴增產(chǎn)物量的變化，最后通過標準曲線和CT值對待測樣品進行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針法。①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中最常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會在過程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號。因此，反應中發(fā)出的全部熒光信號就會與反應中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強度也會隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。優(yōu)點：價格相對較低；使用方便；對DNA模板沒有選擇，通用性好；檢測靈敏度高。缺點：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要通過熔解曲線分析識別擴增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應體系以降低非特異性擴增；不適合進行多重qPCR檢測。②熒光探針法（TaqMan技術）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測中最常用的檢測方法。PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針是一個寡核苷酸，5'端標記一個熒光報告基團（Reporter, R），3'端標記一個淬滅基團（Quencher, Q）。當探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，以至于無法檢測到熒光信號；而當PCR擴增時（在延伸階段），探針會被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報告基團和淬滅基團分離，報告基團發(fā)射底的熒光不會再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一條DNA，就形成一個熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成完全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號累積的越多，熒光強度越大。優(yōu)點：檢測特異性強；靈敏度高；適合進行多重qPCR檢測；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時間和原料成本。缺點：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹底，本底較高；檢測結(jié)果很難判斷實際的擴增特性。圖3 熒光染料法和熒光探針法的工作原理（Cao et al., 2020）注：多重PCR，也稱多重引物PCR或復合PCR，是在一個反應體系中加入兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的一種新型PCR擴增技術。3.數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）數(shù)字PCR即三代PCR，是對原始PCR的另一種改進，是一種能夠?qū)崿F(xiàn)核酸絕對定量的精準檢測技術，基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨立、平行的微反應單元（納升級）中，使每個反應室中平均只有一個拷貝或者沒有目標DNA分子，然后加入熒光信號進行擴增，從而實現(xiàn)靶標核酸分子的絕對計數(shù)，提高檢測靈敏度和準確度。4. 逆轉(zhuǎn)錄PCR（ Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR，將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術靈敏且應用廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進行，一步法是RT反應和PCR反應在同一試管中進行；而在兩步法中兩個反應是分開依次進行的。5.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄）的意思，所以RT-qPCR就是結(jié)合了熒光定量技術的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進行定量檢測分析。因為RT-PCR只可以定性，但不能進行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進行。圖4 RT-qPCR的一步法和兩步法（Soler et al., 2020）1.PCR，通常指的是普通PCR，以雙鏈DNA為模板，以dNTP為底物，定性擴增雙鏈DNA。2.qPCR和Real-time PCR，指的是實時熒光定量PCR，以cDNA為模板，以dNTP 為底物，對擴增出的DNA進行定量分析。3.RT-PCR，指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR，以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，以dNTP 為底物，進行DNA的擴增，屬于PCR的變種，結(jié)果只能定性，不能定量。4.RT-qPCR，指的是實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，是qPCR+RT-PCR的組合，將總RNA或mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再作為模板，以dNTP為底物，進行qPCR的定量分析。Cao Y, Yu M, Dong G, et al. Digital PCR as an Emerging Tool for Monitoring of Microbial Biodegradation. Molecules. 2020,25(3).Lee NY. A review on microscale polymerase chain reaction based methods in molecular diagnosis, and future prospects for the fabrication of fully integrated portable biomedical devices. Mikrochim Acta. 2018,185(6).Soler M, Scholtz A, Zeto R, et al. Engineering photonics solutions for COVID-19. APL Photonics. 2020,5(9). 本文來源信諾金達，版權歸原作者所有，授權轉(zhuǎn)載請聯(lián)系原作者。文章只為學術新聞信息的傳播，不代表本公眾號觀點。如有侵權請聯(lián)系刪除。
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