CRISPR-Cas 系統(tǒng)是原核生物一種抵御外來入侵核酸的免疫系統(tǒng)，已被廣泛用于真核細(xì)胞的基因組編輯。目前基于 CRISPR-Cas 的基因編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳育種、新藥開發(fā)、疾病治療、動物模型構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及分子診斷等各領(lǐng)域。被譽(yù)為在后基因組時代開創(chuàng)了遺傳疾病精準(zhǔn)治療的新時代。

CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以按照效應(yīng)物是多亞基或單亞基分為 Class I 和 Class II（一型和二型）。單亞基效應(yīng)物的 Class II 家族包括大家常用的 Cas9、Cas12、Cas13 等，因其簡單、高效、普適性的特性，其應(yīng)用早已風(fēng)靡全世界實驗室。如果從分布比例上看，多亞基類型的 Class I 家族才是 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的“名門望族”，其占比超過75%，對比 Cas9、Cas12、Cas13 總和也不過10%左右，可謂呈“輾軋之勢”。然而 Class I 家族 CRISPR-Cas 系統(tǒng)，因為多亞基特性，其樣品的獲取，操作的編輯性，功能、機(jī)制的研究等都顯得相對難度更大，因此該家族的研究和應(yīng)用一直滯后很多。

不過近些年，Class I 家族引起低脫靶，低毒性，功能更豐富多彩的特性，正逐漸展現(xiàn)出特有的魅力。不過 Class I 家族龐大，成員眾多，同時每一亞類可能又展現(xiàn)不同的性質(zhì)，因此對這一龐大家族的了解也不透徹。

美國康奈爾大學(xué)可愛龍實驗室在 Molecular Cell 期刊發(fā)表了題為：Allosteric control of type I-A CRISPR-Cas3 complexes and establishment as effective nucleic acid detection and human genome editing tools 的研究論文。該研究報道了基于 type I-A 系統(tǒng)的 CRISPR-Cas3 新機(jī)制解析和新應(yīng)用開發(fā)。

對于 Type I 系統(tǒng)，大家普遍認(rèn)知的工作機(jī)制是 Cascade 首先靶向目標(biāo) DNA，形成 full R-loop 之后,再招募 Cas3 完成對靶標(biāo) DNA 的切割和水解。簡而言之就是：“分—合—分”機(jī)制。然而可愛龍實驗室的胡純一博士等人發(fā)現(xiàn) Type I-A 系統(tǒng)一個顯著不同于 Type I 其他系統(tǒng)的性質(zhì)：Cas3 與 Cascade 是形成一種內(nèi)在的復(fù)合物，而不依賴于目標(biāo) DNA 靶向與否，簡言之就是“合-合-合”。

分分合合與否，固然鮮明。然而 CRISPR 系統(tǒng)最重要的一項性質(zhì)就是：該系統(tǒng)如何去避免脫靶效應(yīng)，從而降低非特異性的切割？

其他的 Type I 系統(tǒng)利用 Cas3 的招募與否來規(guī)避脫靶效應(yīng)（非特異性的靶向不能招募Cas3）。因此，Cas3 一直結(jié)合在 Cascade 上的 type I-A 系統(tǒng)又是如何去規(guī)避這一難點？

胡純一博士聯(lián)合瑞士洛桑大學(xué)/瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院 Henning Stahlberg 實驗室倪冬春博士等人，使用冷凍電鏡全面解析了 type I-A 系統(tǒng)九種狀態(tài)下的全景工作機(jī)制。這些捕獲的工作狀態(tài)橋段，確切的表明，Cas3 通過與 Cas8 的互作，從而成為 Cascade 的內(nèi)在一部分，并且 Cas3 通過穩(wěn)定 Cas8 的 N 端構(gòu)象，極大的促進(jìn)了 PAM 識別和 DNA 靶向，該結(jié)果表面 Cas3 的內(nèi)在性是具有積極和重要作用的。

重要的是，他們發(fā)現(xiàn)，type I-A Cascade 結(jié)合 DNA 形成完全互補(bǔ)配對的 full R-loop 結(jié)構(gòu)之后，通過層層構(gòu)象變化，最終傳遞給 Cas3 產(chǎn)生一個巨大的構(gòu)象改變，暴露核酸酶活性中心，從而開始切割靶向 DNA。而部分結(jié)合（非特異性結(jié)合）靶標(biāo)形成的 partial R-loop 結(jié)構(gòu)不能產(chǎn)生這種刺激，Cas3 核酸酶依然保持抑制狀態(tài)，從而避免脫靶切割 。

眾云“合（和）為貴”，那么這套 type I-A 系統(tǒng)獨(dú)特的吸引力在哪里？

胡純一博士等人發(fā)現(xiàn)，type I-A 內(nèi)在式的 Cascade-Cas3 復(fù)合物在不結(jié)合目標(biāo) DNA 時，完全沒有任何核酸酶性質(zhì)，而當(dāng)有正確的靶標(biāo)出現(xiàn)，激活 Cas3 活性之后，會產(chǎn)生一個附屬活性，從而可以對 FQ-ssDNA 探針（熒光-淬滅-單鏈DNA探針）進(jìn)行切割，產(chǎn)生熒光，因此可以通過熒光的強(qiáng)弱即可判斷是否有目標(biāo) DNA。

團(tuán)隊以此原理，開發(fā)了一套高效快速的核酸分子診斷工具，并命名為“HASTE”（heat-activated streamlined nucleic acid detection platform）。該系統(tǒng)可以在15分鐘之內(nèi)，對單分子量級的 DNA 完成檢測，效果顯著，有著與傳統(tǒng) PCR 一樣可靠的精度，卻極大縮短了時間和成本。

有意思的是，該項工作還發(fā)現(xiàn)，這個 I-A 系統(tǒng) Cas3 的解旋酶活性嚴(yán)格依賴溫度，溫度越高，活性越強(qiáng)。可愛龍團(tuán)隊利用42度溫度刺激，可以開發(fā)一套溫控基因敲除工具，效率超過90%。

因此，在未來，可以利用該性質(zhì)，未來可以在病灶通過局部的溫度刺激來調(diào)控該工具的基因編輯效率，從而最大限度地降低基因編輯工具帶來的脫靶效應(yīng)。