CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在的一種由RNA介導(dǎo)抵抗外援病毒或者核酸入侵的“獲得性免疫系統(tǒng)”。CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為兩大類：I類（Class I）利用多亞基效應(yīng)復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)序列的識別和切割過程；而II類（Class 2）則由單一蛋白來執(zhí)行相關(guān)功能，作用機(jī)制相對簡單【1】，其中Cas9, Cas12以及Cas13 已被開發(fā)成高效的基因編輯工具或者核酸檢測工具，并被廣泛應(yīng)用。I類中的Type I系統(tǒng)是在細(xì)菌中分布最廣泛的CRISPR-Cas，約占目前已發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)的近一半。以Type I系統(tǒng)中研究最為清楚的I-E亞型為例，該亞型對靶標(biāo)DNA的識別依賴于一個由5個不同蛋白組成的超大復(fù)合物Cascade，對靶標(biāo)DNA的切割則是由一個有解旋酶核酸酶雙重功能的特征性蛋白Cas3來執(zhí)行。只有當(dāng)CRISPR RNA和靶標(biāo)DNA完全互補(bǔ)配對（32 bp）且最終形成R-loop時，Cas3才會特異性地募集到Cascade上并被激活酶活性，進(jìn)行長距離DNA降解【2】。盡管分布廣泛且活性特殊，Type I甚至I類CRISPR-CAS系統(tǒng)的可應(yīng)用性一直未能在任何真核系統(tǒng)中得到證明。

2019年4月8日，密歇根大學(xué)安娜堡分校張燕教授/侯仲剛博士研究組和康奈爾大學(xué)可愛龍教授研究組在 Molecular Cell 在線發(fā)表了題為Introducing a spectrum of long-range genomic deletions in human embryonic stem cells using Type I CRISPR-Cas 的最新合作研究成果。這一研究首次使用CRISPR Type Ⅰ型系統(tǒng)中的Cascade靶標(biāo)識別復(fù)合物和Cas3解螺旋酶-核酸酶在人胚胎干細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)高效率大片段基因敲除，為實(shí)現(xiàn)Cascade-Cas3在真核細(xì)胞中基因編輯的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

在本項(xiàng)研究中，研究人員從嗜熱單孢菌（Thermobifida fusca）來源的type I CRISPR-Cas系統(tǒng)入手，首先在Cas7和Cas3兩個亞基上引入核定位序列（NLS），之后在大腸桿菌中表達(dá)純化出Cascade復(fù)合物和Cas3蛋白，并利用電穿孔的方式直接導(dǎo)入到表達(dá)EGFP和tdTomato的人胚胎干細(xì)胞（hESC）的雙重報(bào)告系統(tǒng)細(xì)胞中，解決了這一超大復(fù)合物的遞送和入核問題。通過檢測EGFP和tdTomato熒光信號, 證實(shí)Cascade和Cas3在人胚胎干細(xì)胞中的報(bào)告基因敲除效率可達(dá)到13％。通過長距離PCR和PCR產(chǎn)物測序證明這一結(jié)果完全是大片段基因敲除產(chǎn)生的，而非cascade結(jié)合引起的轉(zhuǎn)錄沉默。用相同的方法，在人類近單倍體細(xì)胞系HAP1中的內(nèi)源基因HPRT1上，敲除效率高達(dá)到60%。有意思的是，由一種特定序列的CRISPR RNA可在人細(xì)胞中產(chǎn)生成千上萬種不同的基因大片段缺失，均位于Cas3靶向位點(diǎn)的上游區(qū)域（即PAM，protospacer adjacent motif方向），且大小從幾百bp到100 kb不等。這意味著由Cas3解螺旋酶核酸酶進(jìn)行的DNA敲除，起始于靶標(biāo)位點(diǎn)附近，而終止點(diǎn)則分布在靶向位點(diǎn)上游很廣泛的區(qū)域。這些特征與定點(diǎn)局部編輯的cas9或cas12形成鮮明對比。

Cas3可以在基因組上進(jìn)行遠(yuǎn)程位移的特點(diǎn)，是Cas9或Cas12所不具備的，因此type I CRISPR-Cas系統(tǒng)在引入遠(yuǎn)程表觀遺傳修飾方向會有廣泛應(yīng)用前景。此外，人類基因組中超過98％的序列是非編碼區(qū)域，其中包括許多對基因調(diào)控和疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要的順式作用元件。然而用于篩選具有調(diào)控性功能的長片段非編碼序列的遺傳學(xué)工具仍然有限。Cascade/Cas3系統(tǒng)能夠利用單個CRISPR RNA在靶向位點(diǎn)上游產(chǎn)生大范圍片段缺失文庫，這可以使得這種功能性篩選更加簡單且成本更低。進(jìn)一步篩選和改造type I CRISPR-Cas系統(tǒng)還可能被用于敲除大片段致病基因等等?；贑ascade/Cas3系統(tǒng)的基因編輯工具將極大地豐富基因敲除的研究手段。

原文鏈接：

https:///10.1016/j.molcel.2019.03.014

制版人：珂

1. Makarova, K.S., Wolf, Y.I., Alkhnbashi, O.S., Costa, F., Shah, S.A., Saunders, S.J., Barrangou, R., Brouns, S.J., Charpentier, E., Haft, D.H., et al. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722–736.

2. Hochstrasser, M.L., Taylor, D.W., Bhat, P., Guegler, C.K., Sternberg, S.H., Nogales, E., and Doudna, J.A. (2014). CasA mediates Cas3-catalyzed target degradation during CRISPR RNA-guided interference. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 6618–6623.