Golgi-Cox浸染法是研究神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞正常和非正常形態(tài)最有效的方法之一。使用Golgi技術(shù)，在藥物處理過的動(dòng)物腦中和因神經(jīng)疾病死亡的病人腦中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)樹突和樹突微小的形態(tài)改變。

原理：用重鉻酸鉀和鉻酸鉀，氯化汞作為初步固定劑浸潤組織，鉻鹽和神經(jīng)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合，氯化汞通過白色沉淀來標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)一步經(jīng)過堿處理，使沉淀物變黑（硫化汞）。該法最顯著的特點(diǎn)是其反應(yīng)終產(chǎn)物都局限于單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)部，而其周圍去多類似的神經(jīng)細(xì)胞不著色，從外觀上看，就好像從固定到脫水的全過程在細(xì)胞膜水平都存在一個(gè)阻止可見產(chǎn)物擴(kuò)散的屏障。

The beauty of the method lies in one of its shortcomings: the Golgi protocol stains only a few hundred neurons out of the millions present. Thus, it is possible to visualize neurons and trace their path and connections in the brain against a pale yellow background with unsurpassed clarity. Without this ability to stain the few select neurons, everything would have looked like a large black blob on the brain section.。

高爾基染色的腦片較厚，如果使用普通玻片貼片，在染色過程中，腦片很容易從玻片上脫落下來，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對此需制備特殊明膠包被載玻片，以供高爾基染色使用。

方法：加熱500 mL雙蒸水，后加入10g明膠，攪拌溶解。待溶解后加入0.5g硫酸鉻鉀，攪拌溶解（此步驟需在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行），定容至1L，過濾冷卻至室溫。將干凈的玻片浸入溶液當(dāng)中，避免氣泡形成。37 °C烤干玻片?？靖珊?℃保存。

2.1在取腦前24小時(shí)提前等量混合A,B液，并不能攪拌。制備好的浸泡液在用之前室

溫黑暗保存可長達(dá)一個(gè)月。每cm3待研究組織至少用5ml浸泡液。注意用較少的浸

泡液可能降低染色的靈敏性和可靠性。

2.2殺死動(dòng)物之前對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行深度麻醉。應(yīng)盡快地從顱骨中取出動(dòng)物的腦（或死去

病人的腦），但操作時(shí)必須非常小心以免損傷或壓迫組織。

2.3用雙蒸水快速沖掉組織表面的血液。

2.4把組織浸泡在由溶液A和B等體積混合的浸漬液中，室溫下黑暗保存兩周*。浸泡

6個(gè)小時(shí)以后或次日更換新的浸漬液。

2.5轉(zhuǎn)移組織到溶液C中室溫黑暗至少72小時(shí)（可長達(dá)1周）。24小時(shí)后或次日至少

更換一次溶液。

3.1 從C溶液中去除組織，擦除表面液體，置于-24℃切片機(jī)中的樣本盤上滴加雙蒸水

包被冰凍。

3.2 使用修塊（Trim）模式進(jìn)行切片，切片厚度100-150 um，按實(shí)際需要調(diào)整切片溫度。

3.3 在寫好標(biāo)記的載玻片上滴一滴C液，可用毛筆涂開。用玻璃分針把樣本轉(zhuǎn)移到玻片

上，使之在C液中展開，注意腦片與載玻片中間不能留有氣泡。載玻片上多余的溶液用吸管吸走并用濾紙吸干（載玻片上的溶液必須盡可能地吸干否則切片將從載玻片上脫落下來）。切片可以室溫下自然風(fēng)干（不能用電風(fēng)扇或電熱板使其干燥）。為取得最佳結(jié)果，應(yīng)盡快地完成切片，制備好的切片如果保存于載玻片盒中，室溫黑暗條件下

最長可保存3天。

在染色過程中和蓋蓋玻片之前的任何一步都不要讓切片變干

4.1 用雙蒸水沖洗切片兩次，每次4分鐘。

4.2 堿化：把切片置于由1份溶液D，1份溶液E和2份的雙蒸水組成的混合液中10分

鐘。比如：溶液D 10ml 溶液E 10ml 雙蒸水 20ml

注意工作液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，每100ml工作液最多用于100張切片（比如小鼠腦），根據(jù)切片的大小。盛有工作液的瓶子或染色罐必須蓋好蓋子防止試劑蒸發(fā)。為取得最佳結(jié)果，孵育期間應(yīng)頻繁攪拌工作液。

4.3 用蒸餾水沖洗切片兩次，每次4分鐘（蒸餾水應(yīng)頻繁更換新的）。

4.4 在50%，75%和95%的乙醇中對切片進(jìn)行脫水，每個(gè)濃度梯度脫水4分鐘（不要跳過

任何一個(gè)步驟）。

4.5 然后在無水乙醇中對切片進(jìn)行脫水，4次，每次4分鐘（不要延長時(shí)間）。

4.6 在二甲苯中透明，3次，每次4分鐘，并且用樹脂封片劑對蓋玻片進(jìn)行封片。

4.7 避光晾干，拍照進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

高爾基染色統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)主要反映在樹突復(fù)雜性(dendritic complexity)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)有樹突分支數(shù)（number of dendritic branch）、樹突長度（dendritic length）、樹突棘密度（dendritic spine density）等。使用ImageJ及一些相關(guān)圖像處理軟件，可以初步統(tǒng)計(jì)以上數(shù)據(jù)。

ImageJ 是一個(gè)基于java 的公共的圖像處理軟件，它是由National Institutes of Health 開發(fā)的。ImageJ 能夠顯示，編輯，分析，處理，保存，打印8 位，16 位，32 位的圖片，支持TIFF,PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS 等多種格式。ImageJ的很多功能都是通過插件來實(shí)現(xiàn)的。比如NeuroJ插件就是用來統(tǒng)計(jì)神經(jīng)元樹突長度的，Sholl Analysis插件用來統(tǒng)計(jì)神經(jīng)元分支數(shù)。

本文中還用到了NeuronStudio和Photoshop等圖像處理軟件。

1.1拍照

在目標(biāo)區(qū)域選取的神經(jīng)元，結(jié)構(gòu)應(yīng)清晰可見，與其他神經(jīng)元交集較少，便于分析。

由于受切片厚度影響，盡量選取完整的神經(jīng)元。選好目標(biāo)神經(jīng)元后在X200物鏡下

拍照。為了盡量使用2D照片還原立體的神經(jīng)元，故應(yīng)不斷調(diào)整焦距拍照，盡量將

單個(gè)神經(jīng)元全貌的各個(gè)細(xì)節(jié)拍下，便于分析。可每旋微焦5°拍下一張照片，依次

可拍下該個(gè)神經(jīng)元的一批照片。注意保存標(biāo)尺，方便后續(xù)分析。

2.1.1 打開文件，F(xiàn)ile→Import→Image Sequence，點(diǎn)擊目標(biāo)文件夾中的一張照片從而選中全套照片，在Sequence Option對話框中點(diǎn)擊OK。即可得到目標(biāo)神經(jīng)元的合成照片，滾動(dòng)鼠標(biāo)輪軸可查看目標(biāo)神經(jīng)元各個(gè)層次的形態(tài)。

2.1.3 保存圖片，F(xiàn)ile→Save as→ConX200@06（*Tiff）

由于合成的圖片較“厚”，遮住了目標(biāo)神經(jīng)元的細(xì)節(jié)，所以需借助圖像軟件“過濾”，是目標(biāo)神經(jīng)元輪廓更為清晰，這里使用NeuronStudio軟件進(jìn)行圖像處理。

2.2.1 打開NeuronStudio，F(xiàn)ile→Open→ConX200@06，導(dǎo)入之前合成的那張圖片。

3.1使用ImageJ打開之前處理好的圖片

3.2 設(shè)置標(biāo)尺，在圖片標(biāo)尺上畫一直線，Analyze→Set Scale→Known Distance(例：50) →unit of length(例：um) →勾選Global→OK

3.4 點(diǎn)擊打開圖片。

3.5 點(diǎn)擊，圖上出現(xiàn)一十字光標(biāo)，右擊目標(biāo)神經(jīng)元胞體，開始追蹤神經(jīng)元，沿著樹突方向移動(dòng)鼠標(biāo)，軟件會相應(yīng)追蹤軌跡，如果軌跡偏離太遠(yuǎn)，可回到樹突上，右擊確定軌跡。追蹤至該樹突末端，雙擊結(jié)束該條樹突的追蹤。如有軌跡有誤，需要?jiǎng)h除，則點(diǎn)擊，把鼠標(biāo)放在該條軌跡上，該條軌跡會高亮，點(diǎn)擊高亮的軌跡，會有對話框提示是否刪除該軌跡，選擇確認(rèn)刪除。用相同方法可追蹤勾勒出整個(gè)神經(jīng)元各級樹突全貌（如下圖）。

3.6測量樹突長度，點(diǎn)擊，點(diǎn)擊對話框中OK。

3.5軟件會自動(dòng)顯示計(jì)算結(jié)果。

3.6 點(diǎn)擊，選擇draw tracing.

3.7 即可得到神經(jīng)元樹突二維分布圖，調(diào)整格式方便下一步進(jìn)行sholl分析。

Image→Type→8-bit,Process→Binary→Make Binary, File→Save as NeuronX（*Tiff）

Sholl Analysis用同心圓環(huán)去考證樹突的長度，即圍繞胞體會出等距的同心圓，然后技術(shù)樹突與同心圓交叉點(diǎn)的個(gè)數(shù)，這樣交叉點(diǎn)的個(gè)數(shù)可以間接反映樹突的長度與分支數(shù)。

該分析可以用ImageJ的Sholl Analysis插件計(jì)算完成。該軟件首先確定神經(jīng)胞體，以此為圓心，以固定長度遞增的半徑畫圓，軟件會自動(dòng)統(tǒng)計(jì)圓與神經(jīng)元相交的情況，從而確定神經(jīng)元樹突與同心圓的交叉點(diǎn)情況。

4.1 打開剛才保存的二維分布圖，F(xiàn)ile→Open→ NeuronX（*Tiff）

4.2 點(diǎn)擊，以神經(jīng)元胞體為一端，畫出包含所有樹突的元的半徑

4.3 Sholl 分析。Plugin →Sholl Analysis,點(diǎn)擊OK。

4.5 保存Sholl profile，數(shù)據(jù)分析。

樹突棘是樹突上的細(xì)小突起，包括頭部和頸部，可分為粗短性、瘦長型和分叉型。每次計(jì)數(shù)均應(yīng)從分支點(diǎn)開始，并量取相應(yīng)節(jié)段樹突分支的長度（大于10μm），將樹突棘數(shù)目除以樹突分支長度，得到樹突棘密度。

可在油鏡下以X100物鏡拍攝樹突棘，選好節(jié)段，調(diào)整好焦距，盡量選取平行于鏡頭平面的樹突進(jìn)行拍攝，印入標(biāo)尺，保存圖片。

5.2 圖像→調(diào)整→黑白，調(diào)整黃色使之“過濾”

5.3圖像→調(diào)整→曲線，拽動(dòng)曲線，使樹突棘調(diào)節(jié)到適合分析的狀態(tài)，保存圖片。

5.4用ImageJ打開圖片，設(shè)置標(biāo)尺（同上）。

5.6 計(jì)數(shù)：點(diǎn)擊Initialize,選擇type1,在ImageJ上將圖片放大到合適大小，移到中間，選擇，移動(dòng)鼠標(biāo)到樹突棘上，右擊開始計(jì)數(shù)。

5.7記下所數(shù)樹突棘數(shù)目，Export Image →Save.

5.8測量：放大已計(jì)數(shù)的目標(biāo)區(qū)域，右擊，選擇Segmented Line,在計(jì)數(shù)端樹突畫線，

雙擊結(jié)束畫線。

5.9 Analyze→Measure，保存結(jié)果，即可計(jì)算出樹突棘密度。

ImageJ下載：http://m./doc/e4ab81e6f46527d3240ce0de.html /ij/

NeuronJ下載：http://m./doc/e4ab81e6f46527d3240ce0de.html /meijering/software/neuronj/

Sholl Analysis下載：http:///Sholl_Analysis

NeuronStudio下載：http://m./doc/e4ab81e6f46527d3240ce0de.html /cnic/tools-ns