核酸質(zhì)控是NGS（Next Generation Sequencing）實驗中必不可少的環(huán)節(jié)，精確的NGS實驗結(jié)果也離不開合格的核酸質(zhì)控。核酸質(zhì)控主要是評估核酸的濃度，完整性、純度及片段大小。

核酸樣本涉及的下游實驗很多，質(zhì)控不合格會影響實驗結(jié)果的準確性，甚至得到錯誤的結(jié)論。NGS實驗中使用質(zhì)量差，如降解程度高的核酸樣本建庫可能導(dǎo)致文庫濃度低，文庫復(fù)雜度低，甚至文庫構(gòu)建失敗等；文庫濃度定量不準確可能導(dǎo)致測序?qū)嶋H分配數(shù)據(jù)量不均，或簇密度波動甚至導(dǎo)致實驗失敗。詳情可參考往期內(nèi)容【新知解讀】測序失敗風(fēng)險排查——多的是你不知道的事

現(xiàn)在市面上主流的核酸質(zhì)控方法有紫外可見吸收光度法（UV-Vis）（如Nanodrop）、熒光染料法（如Qubit）、瓊脂糖凝膠電泳法（如Gel-electrophoresis）、自動化電泳法（如2100 Bioanalyzer）、熒光定量PCR法（如qPCR）等。

如何挑選合適的核酸質(zhì)控方法來保證NGS實驗的順利進展？相信是小伙伴們十分關(guān)注的問題。不要擔(dān)心！今天小石頭帶大家來回顧各種核酸質(zhì)控方法的原理及應(yīng)用。

生物有機分子中的芳香環(huán)，具有紫外吸收的特性。核酸，蛋白質(zhì)、多肽、芳香基團、苯酚以及碳氫化合物均可吸收紫外光。核酸在260 nm波長處具有最高吸收峰，蛋白質(zhì)在280 nm波長處具有最高吸收峰，碳水化合物在230 nm波長處具有最高吸收峰 。

根據(jù)朗伯-比爾（Beer-Lambert）光吸收定律：當(dāng)一束平行單色光垂直入射通過均勻、透明的吸光物質(zhì)的稀溶液時，溶液對光的吸收程度（K）與溶液的濃度（c）及液層厚度（b）的乘積成正比。即：A=Kbc，式中K為吸光系數(shù)；A為吸光度；b為溶液液層厚度（或稱光程長度）；c為溶液濃度。

一般在260 nm下，1 μg/ml DNA溶液在1 cm光徑比色皿中的吸光系數(shù)為0.020，1 μg/ml?RNA溶液在1 cm光徑比色皿中的吸光系數(shù)為0.022。

紫外分光光度計能通過測量入射光穿過樣品后到達檢測器的衰減程度，來表示為溶液中樣品的吸光度值，通過測定吸光度值即可得出待測樣本的濃度。與此同時，還能通過計算A260/A280 和A260/A230的數(shù)值，評估核酸的純度。較純凈的核酸A260/A230應(yīng)大于2.0；較純凈的DNA A260/A280在1.8-1.9，較純凈的RNA A260/A280在1.9-2.0，樣品中如果含有蛋白質(zhì)及苯酚，A260/A280比值會明顯下降。

圖1. 紫外可見吸收光度法原理示意圖

實驗室中紫外可見光度法定量RNA/DNA廣泛使用的是 Nanodrop系列分光光度計。

其優(yōu)勢是：操作簡單，無需樣本制備、染料或標準品；可以直接測量純度比—A260/280 和 A260/230；部分儀器還可識別樣品中的非核酸污染物。其缺點是：不具有選擇性（無法區(qū)分 DNA 或 RNA）；靈敏度有限，無法完成低濃度樣本的精確定量。

圖2.  Nanodrop儀器

基于所使用的是能與特異的靶分子結(jié)合的熒光染料，可選擇性結(jié)合 DNA、RNA 或蛋白，這些熒光染料僅在與靶標結(jié)合時才發(fā)出信號。

樣品被過濾光激發(fā)（在激發(fā)波長處）并由檢測器記錄發(fā)射光（在發(fā)射波長處）。熒光計可根據(jù)激發(fā)波長和發(fā)射波長測量特異性結(jié)合在生物分子和天然熒光分子上染料的熒光信號強度。

通過已知濃度的標準樣品繪制校正曲線，并將樣品的熒光信號擬合到適當(dāng)?shù)幕貧w模型中，即可測量核酸濃度。

實驗室中用熒光染料法測定核酸濃度常用Qubit熒光計。其特異性和敏感性比紫外分光光度計更高，但無法提供核酸純度信息，也無法檢測文庫中的非特異性片段，如引物二聚體，接頭序列等。

根據(jù)靶向分子的不同，Qubit包含dsDNA/總RNA/microRNA/ssDNA/蛋白質(zhì)檢測試劑盒，NGS實驗中樣品定量常用Qubit? 1X dsDNA HS檢測試劑盒。

圖4 Qubit熒光計及其檢測試劑盒

瓊脂糖凝膠電泳可定性分析樣本濃度，片段大小、完整性及純度，但不能準確定量。福爾馬林固定石蠟包埋樣本（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）是NGS腫瘤基因檢測最常用的樣本之一。在文庫構(gòu)建之前，常用瓊脂糖凝膠電泳評估FFPE樣本中制備的DNA的片段完整性。

常用2100 Bioanalyzer對樣品進行分離。該方法采用微流控技術(shù)，在玻璃芯片上蝕刻若干微米級通道，構(gòu)建“微型實驗室”，當(dāng)給芯片加入電壓時，樣品在芯片上的顯微蝕刻管道中進行毛細管電泳。

主要原理為DNA雙鏈可嵌入凝膠-染料基質(zhì)中的熒光染料，利用激光誘導(dǎo)的熒光檢測（laser induced fluorescence，LIF）技術(shù)，儀器自動檢測電泳過程中根據(jù)大小被分離的片段，并將其轉(zhuǎn)換成凝膠狀圖像（條帶）和電泳圖（峰）。

利用已知片段大小和濃度的Ladder和Marker，生成遷移時間與片段大小的標準曲線，通過樣品峰面積對已知濃度的Marker或Ladder面積的比值來對樣品的大小和濃度進行定量。

圖6. 微流控芯片的工作原理

實驗中常用的2100生物分析儀現(xiàn)在已廣泛取代了繁瑣的凝膠電泳技術(shù)成為RNA樣品質(zhì)量控制（QC）的行業(yè)標準，同時在DNA 片段分析和蛋白樣品SDS-PAGE分析方面也正在迅速取代凝膠電泳技術(shù)。目前安捷倫2100生物分析儀有DNA/RNA/蛋白質(zhì)/細胞分析試劑盒與試劑，NGS實驗中如檢測DNA，常選擇DNA 1000 Kit 或 High Sensitivity DNA Kit 對文庫的片段大小進行質(zhì)控。

圖7. 2100生物分析儀及其芯片類型

利用qPCR技術(shù)對產(chǎn)物定量，是在PCR體系中添加可與DNA結(jié)合的熒光染料。游離狀態(tài)的熒光染料幾乎沒有熒光信號，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。

隨PCR循環(huán)數(shù)增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量增加，熒光信號呈指數(shù)增長，而熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。在PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物（熒光信號）達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)稱為Ct值，Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系。

市面上常用羅氏的KAPA hgDNA Quantification and QC Kit 評估DNA質(zhì)量。通過在PCR體系中加入標準品同時擴增，確定標準曲線，從而實現(xiàn)對起始產(chǎn)物濃度進行相對定量。主要針對于人類基因組單拷貝的高度保守區(qū)域的不同位點所設(shè)計的引物預(yù)混液。最小片段所對應(yīng)的引物用于獲得絕對定量的結(jié)果，而額外的引物用于獲得在DNA樣本中可擴增模板量(質(zhì)量高的DNA片段)的信息，原理如圖7。由此所產(chǎn)生的質(zhì)量分數(shù)(即Q-ratios)，可以用于樣本產(chǎn)量或?qū)τ谌鏔FPE DNA等質(zhì)量變化很大的樣本的工作流程進行調(diào)整。除此之外還有應(yīng)用在各種測序平臺對NGS文庫進行精確定量KAPA Library Quantification Kits等試劑盒。

圖8. hgDNA Quantification and QC assay 原理示意圖

目前在NGS實驗中常用的質(zhì)控方法如上，不同的檢測方法各有其特點及應(yīng)用場景，選擇合適的質(zhì)控方法對于下游實驗的順利運行具有極其重要的作用。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，相信簡便的操作、較高的靈敏度、極高的準確性將是核酸檢測技術(shù)的趨勢。

今天的分享就到這里啦，小石頭祝愿老師們都能獲得滿意的實驗結(jié)果~

參考文獻：

[1]核酸定量支持 - 入門 | Thermo Fisher Scientific - CN

[2]RNA/DNA 核酸定量 | Thermo Fisher Scientific - CN

[3]Qubit? 1X dsDNA HS 檢測試劑盒 (thermofisher.cn)

[4]用于樣品質(zhì)量控制的生物分析儀自動化電泳 | 安捷倫 (agilent.com.cn)

[5]KAPA_hgDNA_Quantification_and_QC_Kit_TDS.pdf (roche-diagnostics.cn)