瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作為介質(zhì)的一種電泳方法，其兼具“分子篩”和“電泳的雙重作用。

瓊脂糖(Agarose)是一種線性多糖聚合物，是從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的，當瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。

經(jīng)過化學修飾的低熔點的瓊脂糖，在結構上比較脆弱，因此在較低的溫度下便會熔化，可用于核酸片段的電泳檢測。

瓊脂糖凝膠電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍)，該方法的可信度非常高。

瓊脂糖凝膠電泳的原理

熒光染料檢測核酸的存在

觀察瓊脂凝膠中核酸的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠 (EB) 進行染色，所用的熒光染料含有一個可以嵌入核酸的堆積堿基之間的熒光基團，當染料與核酸結合后呈現(xiàn)熒光。

核酸吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，被結合的染料本身在302nm和366nm有光吸收，這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來，因此，當凝膠中含有游離的EB時即可以檢測到DNA和RNA的存在。

注1：由于EB具有很強的毒性，因此在操作時一定要戴手套，并且最好有專門的區(qū)域進行電泳檢測實驗。

注2：可以使用GoldView染料代替EB，其具有相同的檢測效果，同時毒性要低很多。

電泳區(qū)分核酸大小

核酸會根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，瓊脂糖凝膠電泳即根據(jù)這個原理對核酸進行區(qū)分。

核酸分子在pH高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于核酸的戊糖-磷酸骨架在結構上具有重復性，長度相同的核酸鏈幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。

此外，含有瓊脂糖的凝膠具有網(wǎng)狀結構，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在瓊脂糖凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。

在同樣電場的強度下，核酸分子的遷移速度取決于核酸分子本身的大小和構型以及瓊脂糖凝膠的濃度，簡而言之，分子量較大的核酸遷移速度較慢，分子量較小的核酸遷移速度較快，這就是應用凝膠電泳技術分離核酸片段的基本原理。

瓊脂糖凝膠電泳的操作

試劑配置

5×TBE儲備液：

Tris，54g；

硼酸，27.5g；

0.5M EDTA，20mL，pH為8.0；

蒸餾水1000mL；

4攝氏度保存。

注1：0.5M EDTA配置：向18.61g EDTA中加入一定量的雙蒸水，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，之后在用100mL容量瓶定量。

注2：使用時將儲存液稀釋10倍至0.5×，作為電泳及制膠的緩沖液。

注3：5×TBE緩沖液放置時間過久會沉淀，因此一次性不要配太多。

注4：工作用電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

制膠

根椐制膠量及凝膠濃度，向三角錐形瓶中加入指定體積的0.5×TBE緩沖液和準確稱量的瓊脂糖粉；

將錐形瓶放入微波爐中加熱溶解瓊脂糖；

使溶液冷卻至50℃～60℃左右，加入EB染料，并充分混勻；

將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子；

在室溫下使膠凝固，大約30分鐘~1小時。

其它注意事項：

一般小膠需要緩沖液30～40mL，大膠70～80mL；

加熱火力不要太大，以防緩沖液沸騰后溢出錐形瓶；

可以反復多次加熱，以保證瓊脂糖完全溶解；

如使用GoldView染料，加熱后無需冷卻即可直接添加染料；

染料添加量為小膠2μL，大膠4μL。

上樣

取適量樣品與6×loading buffer混勻 (一般為5μl樣品加1μl 6×loading buffer)，用微量移液槍小心加入樣品孔中；

將5μl marker用微量移液槍小心加入到樣品孔中；

每加完一個樣品要更換槍頭，以防止互相污染；

注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

電泳

加完樣后，合上電泳槽蓋，接通電源；

設置合適的電壓和電流，開始電泳；

當條帶移動到膠塊2/3以上時，停止電泳；

在凝膠成像系統(tǒng)中拍照并觀察。

檢測DNA一般采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，低電壓長時間進行，至少要用lambda DNA或Hind III DNA marker。

檢測RNA一般采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓150V～180V，電泳30min左右。

瓊脂糖凝膠電泳的結果

理想的電泳結果

DNA的電泳：如果在23kb處有一條完整或略脫尾的條帶，則證明DNA完整性很好。

RNA電泳中一般會出現(xiàn)3個條帶，分別為28S、18S和5S rRNA，有時5S rRNA檢測不到。

電泳結果異常及可能原因分析

加樣孔有熒光

出現(xiàn)這種情況通常為蛋白質(zhì)殘留，雖然蛋白質(zhì)不會被熒光染料染色，但蛋白質(zhì)會與比較大的核酸結合，使得核酸不能跑出上樣孔，因而在孔中產(chǎn)生熒光。

核酸降解

核酸降解的現(xiàn)象主要表現(xiàn)為，主帶并不突出，向小片段方向發(fā)生彌散，亮度比較均衡地衰減。

以目前核酸提取方法的能力，在裂解和提取過程中除了操作失誤幾乎并不會導致核酸的降解，所以出現(xiàn)提取核酸降解的情況，一般為樣品本身在提取前就有一定程度的核酸降解。

樣品本身出現(xiàn)核酸降解一般分為兩種，一種是樣品采集和保存出現(xiàn)問題，比如以RNA提取為目的的樣品在采集后在常溫下存放了很長時間；另一種是樣品本身就存在一定的核酸降解，比如土壤或沉積物樣品中本身就存在很多長短不一的胞外DNA。

核酸提取失敗

一般核酸提取失敗的結果顯示為沒有明顯的主帶，而是在一個較大的范圍內(nèi)呈現(xiàn)彌散狀態(tài)。

不同類型核酸殘留

在DNA或RNA提取過程中，可能會出現(xiàn)其它類型核酸殘留的現(xiàn)象，比如在提取的DNA中存在RNA殘留，或者在提取的RNA中存在DNA殘留，此時的電泳結果會同時觀察到DNA和RNA。

針對這種情況的處理辦法是在提取過程中添加一步DNase或RNase的處理，以去除不是提取目標的核酸。

制膠不合格

如果電泳的結果顯示marker跑的都有問題，那一般就是制膠的過程出現(xiàn)了問題，建議首先重新配置TBE緩沖液，并重新制膠，確保在制膠過程中瓊脂糖混合均勻。

其次是要更換電泳槽中的緩沖液，電泳槽中緩沖液使用時間過長會影響其導電能力。

如果問題依然出現(xiàn)，就要考慮是不是瓊脂糖的問題，現(xiàn)在國內(nèi)市場上假的瓊脂糖非常多，本人就遇到過因為瓊脂糖是山寨貨而導致電泳一直出現(xiàn)問題的情況。