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熒光補償是指修正熒光光學(xué)信號在探測器之間相互滲漏并被數(shù)字化檢測的過程。自單激光雙色分析出現(xiàn)后，此過程變得十分重要。每種熒光素分子都具有自身的光譜發(fā)射范圍。這些發(fā)射光譜之間存在相互疊加，在某些情況下此現(xiàn)象十分明顯。 舉例來說，如下圖為FITC與PE熒光發(fā)射光譜的疊加情況。在一個雙探測器系統(tǒng)中，可設(shè)計將FITC熒光從PE熒光中分離出來。檢測熒光發(fā)射光時根據(jù)其波長和分布將選擇其中一小部分進(jìn)入探測器，這部分熒光可由不同的濾光片從全部發(fā)射光中選擇特定波長范圍的熒光來獲得。這樣FITC熒光由530nm的濾光片選擇后送入探測器中；PE熒光則是由575nm濾光片來選擇。但是有部分FITC熒光會出現(xiàn)在PE探測器中，這是因為它的發(fā)射光涵蓋兩個探測器濾片的過濾范圍。這部分信號我們稱之為熒光滲漏，因為它是由FITC熒光滲漏到PE探測器中的。
注意想要設(shè)計一組熒光濾片來只收集FITC或PE信號是不可能的；因為當(dāng)同時使用這兩種熒光染料時熒光疊加總是存在的。這樣只要FITC熒光存在，就會在530nm區(qū)得到一個信號，同時也會在575nm區(qū)得另一些信號。如這時有PE熒光存在，它也將在575nm區(qū)收集。那我們?nèi)绾尾拍苡嫈?shù)多少信號是來自PE而又有多少信號是由FITC引起的呢？這個計算過程我們稱為“熒光補償”，如去除FITC在PE發(fā)射光譜帶上的熒光來修正PE探測器中的信號。 一步法熒光補償 如果一種熒光染料的發(fā)射光可以被兩個含有不同波段的濾光片的探測器檢測到，那么就能根據(jù)其中一個探測器的信號計算出另一個探測器中有多少信號。這是因為這兩個信號是成比例變化的（如下圖）。這個恒定特性是指我們能夠根據(jù)綠色熒光探測器中曲線面積來精確推算出橙色熒光探測器的曲線面積。 這兩個值的比值可在沒有FITC以外熒光的情況下計算得知。用于此目的的樣本被稱為“熒光補償調(diào)節(jié)樣本”或是“熒光補償質(zhì)控物”，用于精確測定補償值。對于典型的流式細(xì)胞儀來說，F(xiàn)ITC發(fā)射光在橙色探測器中的信號大概是綠色探測器的15%。因此，如果我們從橙色探測器中減去綠色探測器信號的15%，那無論有多少FITC信號存在，經(jīng)校準(zhǔn)后的橙色熒光探測器信號將總為零。這時可在系統(tǒng)中加入PE熒光，橙色熒光探測器扣除了15%的綠色信號后將顯示真正的PE熒光信號，而不用再考慮是否存在FITC熒光了。這就是“一步法”熒光補償；在第二探測器中修正來自另一熒光的信號。 二步法（雙）熒光補償 從下圖的熒光譜中可見PE熒光也有部分滲漏至FITC探測器中。通過檢測只有PE熒光的細(xì)胞來獲知此比例，一般它的數(shù)值是2%左右。這稱之為PE熒光補償校正物。 但如果PE熒光出現(xiàn)在FITC探測器中，而同時我們又使用FITC熒光來修正PE探測器中的熒光信號，那這還能有可能來正確修正熒光滲漏從而得到真正的熒光信號嗎？試劑上，根據(jù)一些數(shù)學(xué)運算是有可能使用這種方法來精確調(diào)節(jié)補償?shù)摹?/p>
現(xiàn)在流式細(xì)胞儀都是自動調(diào)節(jié)熒光補償，不過也要做好準(zhǔn)備工作。如當(dāng)我們同時檢測四種熒光素FITC、PE、Per CP、APC，做補償調(diào)節(jié)，需要以下的樣本，無任何染色的樣本，F(xiàn)ITC， PE， Per CP以及APC單染陽性的樣本，這里需要一共5個管子。 在純手工的年代，你需要畫出這四個顏色兩兩配對的散點圖，比如FITC-PE， FITC-Per CP， FITC-APC， PE-Per CP，PE-APC， Per CP-APC，一共6個散點圖。 然后，先上未染色的樣本，調(diào)節(jié)各個熒光通道的電壓，使細(xì)胞都位于各個散點圖的左下角。 在記錄前，把每個樣本都先跑一邊，目的是觀察電壓的設(shè)置是否正確。比如FITC和PE會有重疊，上FITC陽性管的時候，雖然其他通道會有些信號，但FITC通道的信號應(yīng)該最強。如果發(fā)生了其他通道信號強于目的通道的情況，就要進(jìn)一步調(diào)節(jié)電壓，使目的通道的信號最強。這樣把每一個單染的樣本都過一遍，確保目的通道的信號最強。 現(xiàn)在的儀器軟件，不需要你自己畫這些散點圖，但是調(diào)節(jié)電壓的這一步是必須的，可以在陰性對照管的頁面下完成。 電壓調(diào)節(jié)好以后，記錄陰性對照和陽性單染樣本的信號，然后機(jī)器會自動計算補償值。 如果你要手工計算，這里是原則： 以FITC-PE為例。在散點圖上，劃分為四個象限。如果縱坐標(biāo)是FITC， 橫坐標(biāo)是PE。調(diào)節(jié)電壓后，陰性的細(xì)胞位于左下象限。這時可以得出陰性細(xì)胞橫坐標(biāo)（PE）和縱坐標(biāo)（FITC）的平均熒光強度值。電壓調(diào)好以后，上單色陽性樣本。比如上牌FITC陽性，這時不要再改變電壓了，而是調(diào)節(jié)補償系數(shù)，最終目的就是讓FITC陽性的細(xì)胞都位于向下象限，并且該細(xì)胞團(tuán)的縱坐標(biāo)（PE）熒光強度和陰性細(xì)胞團(tuán)的值一致。其他顏色的兩兩補償以此類推。 文章來自：每日生物評論，歡迎關(guān)注微信公眾號:每日生物評論 |
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