流式細(xì)胞術(shù)工作原理是在細(xì)胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點，是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。

1.其測定細(xì)胞內(nèi)DNA的變異系數(shù)最小，一般在2%以下；

2.能準(zhǔn)確地進(jìn)行DNA倍體分析；

3.借助于熒光染料進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究；

4.快速進(jìn)行細(xì)胞分選和細(xì)胞收集；

5.醫(yī)學(xué)應(yīng)用：免疫功能研究各種干細(xì)胞的檢測，癌癥病人的多藥耐藥性，細(xì)胞功能及代謝動力學(xué)研究，血小板分析（心血管疾病），流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究；

6 應(yīng)用于外周血內(nèi)皮細(xì)胞測定、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等尖端領(lǐng)域。

流式細(xì)胞儀（FCM）結(jié)構(gòu)一般分為5部分：

流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；

激光光源及光束成形系統(tǒng)；

光學(xué)系統(tǒng)；

信號檢測、存貯、顯示、分析系統(tǒng)；

細(xì)胞分選系統(tǒng)。

流動室（Flow chamber）是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。

流動室充滿鞘液，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體力學(xué)聚焦，保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等。

圖：FCM的流動室和液流系統(tǒng)

目前臺式機FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光是一種相干光源，提供單波長、高強度、穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源。

激光光束在達(dá)到流動室前，先經(jīng)過透鏡聚焦，形成稍大于細(xì)胞直徑的光斑。

FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器。

在FCM的光學(xué)系統(tǒng)中主要光學(xué)原件是濾光片（Filter），主要分成3類：長通濾片（long-pass filter，LP）、短通濾片（short-pass filter，SP）及帶通濾片（band-pass filter，BP）。   

長通濾片：長通濾片使特定波長以上的光通過，特定波長以下的不通過。如LP500濾片，將允許500um以上的光通過，而500um以下的光吸收或返回。

短通濾片：與長通濾片相反，特定波長以下的光通過，特定波長以上的光吸收或返回。如SP500濾片，將允許500um以下的光通過，而500um以上的光吸收或返回。

帶通濾片：帶通濾片可允許相當(dāng)窄的一波長范圍內(nèi)光通過，一般濾片上有兩個數(shù)，一個為允許通過波長的中心值，另一為允許通過光的波段范圍。如BP500/25表示其允許通過波長范圍為475um-525um。

散射光信號：散射光分為前向角散射（forward scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向角散射（side scatter，SSC），散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)（如染色），因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。

1）前向角散射：前向角散射與被測細(xì)胞的大小有關(guān)，確切說與細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細(xì)胞的干擾。

2）側(cè)向角散射：側(cè)向角散射是指與激光束正交90?方向的散射光信號，側(cè)向散射光對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。

以上兩種信號都是來自激光的原光束，其波長與激光的波長相同，目前采用這兩個參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細(xì)胞處理后外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞三個細(xì)胞群體，或在未進(jìn)行裂解紅細(xì)胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細(xì)胞等細(xì)胞群體。

熒光信號：當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細(xì)胞自身在激光照射下，發(fā)出微弱熒光信號，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特殊熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析，就能了解所研究細(xì)胞參數(shù)的存在與定量。

激光作用原理

數(shù)據(jù)的顯示通常有一維直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖等幾種。

圖：肺癌細(xì)胞DNA含量的Modifit LT分析直方圖

（橫坐標(biāo)——DNA含量；縱坐標(biāo)——細(xì)胞數(shù)量）

圖：肺癌細(xì)胞DNA含量的CellQuest分析直方圖

（橫坐標(biāo)——FL2-A：細(xì)胞面積；縱坐標(biāo)——細(xì)胞數(shù)）

圖：肺癌細(xì)胞DNA含量的假三維圖

圖：肺癌細(xì)胞DNA含量的二維散點圖

FL2-W——細(xì)胞寬度；FL2-H——細(xì)胞面積

圖：肺癌細(xì)胞DNA含量的等高線圖

FL2-W——細(xì)胞寬度；FFL2-A——細(xì)胞面積

流式儀通過內(nèi)置激光器激發(fā)熒光染料，將488nm或633nm的光轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪徊ㄩL的光，并通過光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，由計算機統(tǒng)計處理變?yōu)榭勺x數(shù)據(jù)。

事實上，各熒光素的發(fā)射波長呈正態(tài)或偏態(tài)分布，如圖。若同時使用兩種熒光染料，就會出現(xiàn)發(fā)射光譜相互疊加的現(xiàn)象。

圖：受激光照射后FITC和PE分子發(fā)射光譜互相干擾圖

FITC無PE熒光檢測補償調(diào)節(jié)示意圖

PE無FITC熒光檢測補償調(diào)節(jié)示意圖

A：陰性對照管（IgG-FITC/IgG-PE）

通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群體落在FITC及PE雙陰性區(qū)。

陰性對照實際為沒有特異性的、與抗體蛋白亞型一致的動物免疫球蛋白。由于化學(xué)鍵、生物鍵及分子之間的吸引作用，這些蛋白會與標(biāo)本中的細(xì)胞結(jié)合，在流式細(xì)胞儀上可檢出一定的信號。

當(dāng)熒光特異性抗體與標(biāo)本結(jié)合時，會產(chǎn)生兩部分信號：非特異信號（即同陰性對照的信號）和特異性結(jié)合信號。所以我們只認(rèn)為大于陰性對照的信號才是由特異結(jié)合而引起的信號并將其歸入統(tǒng)計范圍。

圖：PE和FITC分子的陰性對照

B：FITC標(biāo)記抗體/IgG-PE）

在理想情況下（沒有熒光干擾），因為檢測管中只含有PE標(biāo)記的IgG陰性對照，所以仍將沒有任何信號出現(xiàn)。但實際上，在PE坐標(biāo)上出現(xiàn)了陽性信號。這個信號就是由于FITC熒光漏入PE探測器中而引起的。此時就要取一合適百分比的FITC信號相乘后去抵消PE中的信號。（此時電壓已通過陰性對照設(shè)定，絕對不可變動！）

未調(diào)節(jié)補償?shù)碾p參數(shù)直方圖

當(dāng)將FITC漏入PE的信號恰好全部減除時，即PE信號與原本本底相同時，此時的補償便是正確的，即FITC單陽性細(xì)胞的PE的平均熒光強度與雙陰性細(xì)胞PE熒光強度一致。

由上圖可知，調(diào)節(jié)熒光補償首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，即通過A管調(diào)節(jié)電壓確定陰性范圍。其次，在檢測FITC標(biāo)記管中，必須存在陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞；只有這樣才能有本底參照將PE的信號降至與本底一致而不會過多或過少的調(diào)節(jié)補償。

圖：FITC熒光信號補償?shù)恼{(diào)節(jié)

流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析目的就是需要確定所要研究的目的細(xì)胞器,這就涉及到設(shè)門。設(shè)門就是劃定某一區(qū)域的細(xì)胞群體,對其單獨加以分析或分選。門的形狀可任意,方法有：

(1)閾值設(shè)門。FSC(前向散射光)是最常用的閾值參數(shù)。FSC 和細(xì)胞的大小正相關(guān)。用FSC 設(shè)閾值,可以使低于該閾值的細(xì)胞碎片等其他雜質(zhì)的信號不被處理。

(2)散射光設(shè)門。以FSC 和SSC(側(cè)向散射光)聯(lián)合設(shè)門較常用。其最大優(yōu)點是可以排除碎片或噪聲的?？梢愿鶕?jù)FSC vs SSC 散點圖上不同細(xì)胞分布不同來設(shè)門目的細(xì)胞群。

注意事項

設(shè)門是一種主觀行為，所以要盡可能客觀。需要考慮以下因素：

1、排除細(xì)胞碎片（建立一個FSC vs SSC點圖，確定所有分析細(xì)胞群在點圖可視范圍內(nèi)，細(xì)胞碎片、氣泡和激光背景噪的感染設(shè)在FSC-low的區(qū)域，在SC vs SSC中圈出感興趣的細(xì)胞群的周圍區(qū)域R1，這個區(qū)域可以被稱為R1-FSC vs SSC）

2、應(yīng)用合適的熒光陰性對照（對照組用熒光同型抗體感染靶細(xì)胞，以區(qū)分陽性信號和陰性熒光背景。）

3、排除死細(xì)胞（用PI或者7-ADD標(biāo)記活細(xì)胞，然后圈出活細(xì)胞區(qū)域）

4、如果合適，使用一種共享標(biāo)記物

5、設(shè)置必需的熒光分析點圖

淋巴細(xì)胞分型—— 雙色法檢測外周血T、B、NK細(xì)胞試劑組合

淋巴細(xì)胞分型—— CD14/CD45設(shè)“門”確定淋巴細(xì)胞

T、B和NK細(xì)胞百分比總和應(yīng)等于100%的淋巴細(xì)胞，但在實際中由于在FSC vs SSC中淋巴細(xì)胞設(shè)“門”中，會混入細(xì)胞碎片、單核及粒細(xì)胞，所以很難達(dá)到100%的比例。

如運用CD14/CD45設(shè)門來確定淋巴細(xì)胞“門”，則CD3細(xì)胞百分比 + CD19細(xì)胞百分比 + CD3-/(CD16+56)+細(xì)胞百分比應(yīng)等于CD14/CD45中淋巴細(xì)胞百分比±5%，最大不得超過±10%。

淋巴細(xì)胞分型——CD3/CD19區(qū)分T、B淋巴細(xì)胞

CD3是T細(xì)胞特異性抗原，CD19則可用來識別B細(xì)胞。若用CD3/CD19雙標(biāo)試劑，沒有雙陽性細(xì)胞群體存在，CD3、CD19表達(dá)為獨立的單陽性細(xì)胞群體。這樣就可不用同型對照來設(shè)定陰性或陽性界限。

CD3/CD19不僅可用來設(shè)定標(biāo)本的陰性和陽性界限，它還可用來檢查儀器的補償設(shè)置和非特異性結(jié)合。應(yīng)用該組合檢測時，會出現(xiàn)3群彼此獨立的細(xì)胞群，如細(xì)胞分群不清或位置發(fā)生偏差則要對樣本進(jìn)行仔細(xì)分析。

用熒光標(biāo)記雙參數(shù)檢測外周血成熟T細(xì)胞（CD3+/CD19-細(xì)胞為80.65%）

淋巴細(xì)胞分型—— CD3/CD4鑒定CD4+ T淋巴細(xì)胞

首先用CD3來區(qū)分全部T細(xì)胞。CD3/CD4雙陽性的為真正的Th細(xì)胞。這些細(xì)胞主要是HIV病毒感染對象。

CD3-/CD4+細(xì)胞群體是由單核細(xì)胞組成的。這些細(xì)胞相對于CD4+T細(xì)胞來說弱表達(dá)，在光散射參數(shù)的位置分布也較廣。CD3/CD4抗體組合能完全將CD4+T細(xì)胞與CD4+的單核細(xì)胞區(qū)分開來。

此管也可檢測補償及非特異性結(jié)合情況。CD3+/CD4-細(xì)胞群體應(yīng)明顯地與CD3/CD19中CD3+細(xì)胞群位置相重合。

用熒光標(biāo)記雙參數(shù)檢測外周血輔助T細(xì)胞（CD3+/CD4+細(xì)胞為4.65%）

淋巴細(xì)胞分型—— CD3/CD8鑒定CD8+ T淋巴細(xì)胞

同時表達(dá)CD3/CD8的細(xì)胞群才是真正的CD8+T淋巴細(xì)胞，CD8的表達(dá)包括弱陽性和強陽性部分。CD3-/CD8+細(xì)胞包括一部分NK細(xì)胞和少數(shù)粒細(xì)胞。這些細(xì)胞弱表達(dá)CD8+，由于缺少CD3，易于從CD3+/CD8+T淋巴細(xì)胞相區(qū)別。

雙標(biāo)試劑可用來檢查補償設(shè)置和非特異性結(jié)合情況。雙陰性細(xì)胞可視作內(nèi)部的陰性對照。CD3陽性群體應(yīng)與CD3/CD19、CD3/CD4中的CD3陽性群體處于同一位置。

用熒光標(biāo)記雙參數(shù)檢測外周血抑制T細(xì)胞（CD3+/CD8+細(xì)胞為19.00%）

淋巴細(xì)胞分型—— NK細(xì)胞

CD16（FcRⅢ）表達(dá)于大多數(shù)NK細(xì)胞上，但也表達(dá)于中性粒細(xì)胞上，這種抗原在NK細(xì)胞的表達(dá)比較弱并在NK細(xì)胞活化時丟失。

CD56表達(dá)于大多數(shù)的（但并不是全部）NK細(xì)胞上，也表達(dá)于一些T淋巴細(xì)胞上。與CD3聯(lián)合使用，可以區(qū)分CD3+/CD56+T淋巴細(xì)胞和CD3-/CD56+NK細(xì)胞。

聯(lián)合使用三種單抗能最完全的鑒定所有的NK細(xì)胞。NK細(xì)胞或表達(dá)CD16，或表達(dá)CD56，但它們不表達(dá)CD3。CD16和CD56聯(lián)合使用，根據(jù)熒光強度可將NK細(xì)胞從雙陰性細(xì)胞中區(qū)分出來。這樣運用該組試劑，NK細(xì)胞可形成獨立的群體與其它細(xì)胞相區(qū)分。

圖：用熒光標(biāo)記雙參數(shù)檢測外周血NK細(xì)胞（CD3-/CD(16+56)+細(xì)胞為14.43%）