學(xué)會這幾點，輕松掌握神經(jīng)元操控之化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)

吉凱工具病毒 2020-09-22

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化學(xué)遺傳學(xué)（Chemogenetics）技術(shù)作為與光遺傳學(xué)類似的技術(shù)，其發(fā)生發(fā)展早于光遺傳學(xué)技術(shù)，自1991年Strader 設(shè)計了一個突變β2-adrenaline受體開始，至2007年Armbruster 和Roth開發(fā)出只由特定藥物激活的受體DREADDs后，化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)被廣泛的應(yīng)用在了神經(jīng)研究領(lǐng)域（圖1）。其基于遺傳學(xué)原理，利用化學(xué)小分子工具實現(xiàn)對目的細胞興奮或抑制的調(diào)控。

圖1. 化學(xué)遺傳學(xué)發(fā)展進程

技術(shù)原理

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors, GPCRs）是神經(jīng)元中最大的一類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，決定了下游效應(yīng)系統(tǒng)的起始。GPCRs對神經(jīng)元活性具有激發(fā)、抑制或其它調(diào)節(jié)作用。因此通過遺傳學(xué)手段對GPCRs改造，使其能被特異性的小分子化學(xué)藥物結(jié)合而對內(nèi)源配體不敏感，當小分子化學(xué)藥物與改造后的GPCRs結(jié)合后會激活其下游信號通路，進而導(dǎo)致細胞興奮或抑制（圖2）。因此化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)主要由三部分組成：化學(xué)遺傳學(xué)受體、化學(xué)遺傳學(xué)受體表達遞送、誘導(dǎo)藥物。

圖2. 化學(xué)遺傳學(xué)作用原理

化學(xué)遺傳學(xué)受體

自1991年Strader設(shè)計了一個突變β2-adrenaline,受體，其不能識別內(nèi)源的adrenaline,但可以被L-185870激活，證實了化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)的可行性。接著在1998年，Coward開發(fā)了一系列編輯的受體，稱為RASSLs。最初的RASSL是對 opium 受體的改造，使其對內(nèi)源的多肽配體不敏感，但能夠被 opium 受體激動劑強烈的激活。之后更多的RASSL被開發(fā)用來研究味覺編碼等等（Mueller et al. 2005, Zhao et al. 2003，Conklin et al. 2008）。然而其在神經(jīng)領(lǐng)域的應(yīng)用一直被限制。2007年Armbruster 和Roth開發(fā)出了適用于神經(jīng)研究的基于對GPCRs的DREADD技術(shù)平臺。

通過改造得到hM1Dq、hM2Di、hM3Dq、hM4Di、hM5Dq等受體，其中hM2Di和hM4Di為抑制性受體，hM1Dq、hM3Dq、hM5Dq為興奮性受體。在神經(jīng)研究中，常用hM3Dq和hM4Di分別激活和抑制某些神經(jīng)元來進行功能研究，它們作用機制如圖3所示。

圖3 . hM3Dq（A）和hM4Di（B）作用機制

化學(xué)遺傳學(xué)受體表達遞送

跟光遺傳學(xué)技術(shù)一樣，在應(yīng)用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)時主要利用工具病毒來實現(xiàn)遺傳改造受體在特定細胞中特異性地穩(wěn)定表達，目前以AAV載體為主。

吉凱基因目前已開發(fā)出大量的化學(xué)遺傳學(xué)AAV載體現(xiàn)貨產(chǎn)品（表1），包含廣譜表達的、組織特異性表達的、Cre誘導(dǎo)表達的以及多種熒光標簽，對于有其它需求的我們還可以快速定制個性化產(chǎn)品，助力廣大科研人員的研究工作。

當前使用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)的誘導(dǎo)藥物主要是Clozapine-N-oxide（CNO），其可以通過不同方式給藥（圖4），通常如果要觀察長期調(diào)控過程中行為變化情況，則直接在小鼠飲用水中加入CNO即可，操作簡單方便。如果需要多次短暫調(diào)控，則建議通過腹腔注射的方法在需要調(diào)控時間點前半小時給小鼠CNO處理。由于CNO代謝產(chǎn)物為氯氮平，其是一種精神類藥物，因此全身性的給予CNO可能對小鼠產(chǎn)生一定的副作用，且無區(qū)域特異性，所以可以通過腦立體定位注射的方式直接將CNO注入目標腦區(qū)進行調(diào)節(jié)，即減弱了副作用又實現(xiàn)了區(qū)域特異性調(diào)控。

圖4. 化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)中常用CNO給藥方案

化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

在應(yīng)用化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)時，其實驗流程如圖5所示，主要分為四步：

第一步：選擇合適的化學(xué)遺傳學(xué)受體；

第二步：利用工具病毒載體在細胞中表達化學(xué)遺傳學(xué)受體；

第三步：給予小分子化學(xué)藥物處理，激活化學(xué)遺傳學(xué)受體；

第四步：記錄或觀察動物行為學(xué)變化，確定神經(jīng)元或神經(jīng)環(huán)路功能。

圖5. 化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)實驗流程圖

應(yīng)用方向

化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)廣泛的應(yīng)用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物開發(fā)、功能基因組學(xué)等方面的研究，在神經(jīng)領(lǐng)域其應(yīng)用主要在于神經(jīng)環(huán)路功能的驗證，尤其是當實驗室沒有光遺傳學(xué)技術(shù)平臺設(shè)備時，化學(xué)遺傳學(xué)低門檻易操作的優(yōu)點使其成為神經(jīng)環(huán)路研究的優(yōu)選，包括中樞內(nèi)的神經(jīng)環(huán)路、中樞到外周的神經(jīng)環(huán)路以及特定神經(jīng)環(huán)路功能的驗證。

應(yīng)用案例

案例1：神經(jīng)環(huán)路功能驗證

2019年南京醫(yī)科大學(xué)朱東亞教授團隊在The Journal of Neuroscience 上發(fā)表其研究成果，發(fā)現(xiàn)前扣帶回皮層至腹側(cè)海馬的神經(jīng)環(huán)路是介導(dǎo)條件恐懼記憶泛化的關(guān)鍵神經(jīng)環(huán)路。在研究功能相關(guān)性時作者用了化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)，在ACC、vHPC、dHPC腦區(qū)分別注射AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine，給予CNO處理后有效的抑制各腦區(qū)神經(jīng)元的活動，表明了AAC和vHPC腦區(qū)與恐懼記憶泛化相關(guān)（圖6）。

圖6. 化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)驗證AAC、vHPC腦區(qū)神經(jīng)元與恐懼記憶泛素化的關(guān)系（Xin-Lan Bian,et al., The Journal of Neuroscience, 2019）

案例2：特定神經(jīng)元功能驗證

2019年河北醫(yī)科大學(xué)王升教授團隊在The Journal of Neuroscience 上發(fā)表的研究成果中，給予Phox2b-Cre小鼠孤束核注射AAV2-EF1α-DIO-hM3Dq-mCherry，在Phox2b陽性神經(jīng)元中特異性表達hM3Dq，給予CNO處理后激活孤束核區(qū)域Phox2b陽性神經(jīng)元進而探究孤束核Phox2b陽性神經(jīng)元在呼吸調(diào)控中的作用（圖7）。

圖7. 化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)研究Phox2b陽性神經(jīng)元在呼吸中的功能（Congrui Fu，et al., The Journal of Neuroscience, 2019）

最后，化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)因具有非侵入性、作用時程長、操作簡單等優(yōu)勢，無需埋置光纖，小鼠活動自由度不受限制，且給藥方式簡單效果持續(xù)時間久，為人們探究不同行為的調(diào)控神經(jīng)環(huán)路提供了更便捷的技術(shù)平臺。吉凱基因也將持續(xù)優(yōu)化化學(xué)遺傳學(xué)病毒載體，更好的服務(wù)于廣大科研人員的研究工作。

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