蛋白間相互作用的研究通常為醫(yī)學基礎(chǔ)科研中的難點，因為涉及到蛋白間結(jié)合、結(jié)合后功能及結(jié)合位點驗證，相關(guān)的實驗難度也是非常之高。本次解讀的文獻于近期發(fā)表在《Cancer Cell》雜志（IF=26.6），詳細闡述了三元蛋白交互作用在胃癌中的研究思路，并根據(jù)結(jié)合位點設(shè)計了具有治療作用的小分子多肽，為研究靶向藥物提供了依據(jù)。整個研究內(nèi)容詳實、邏輯嚴謹，研究思路不僅僅局限于癌癥，可以為大家探索蛋白交互作用及相關(guān)臨床轉(zhuǎn)化提供思路。

Hippo信號通路是一條抑制細胞生長的通路，由一系列保守的激酶（MST1/2、LAST1/2）組成，主要通過抑制下游轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ，阻止其入核，進而抑制相關(guān)基因（包括CTGF、CYR61等促瘤基因）的表達。

 （圖片來源：CST網(wǎng)站）

Hippo信號通路失調(diào)在眾多癌癥發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，包括胃癌。已知MST1/2功能缺失可以導致腫瘤發(fā)生，然而在腫瘤中卻很少發(fā)現(xiàn)MST1/2突變，其中一個原因可能是磷酸酶介導的MST1/2去磷酸化進而使其喪失功能，然而這一過程背后的具體機制及其在腫瘤發(fā)生過程中的作用還不完全清楚。本文研究者擬在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)探究胃癌中磷酸酶介導MST1/2被抑制的機制，力求重新恢復(fù)Hippo通路的抑癌活性，為設(shè)計治療藥物提供依據(jù)。

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利用siRNA方法篩選到STRN3是抑制Hippo通路的一個PP2A調(diào)節(jié)亞基

可逆磷酸化過程是調(diào)節(jié)Hippo通路功能的關(guān)鍵，因此研究者首先想找到在胃癌發(fā)生過程中失活MST1/2的特異性磷酸酶。利用兩步siRNA篩選策略，研究者發(fā)現(xiàn)了STRN3（磷酸酶PP2A的一個調(diào)節(jié)亞基）抑制MST1/2的效果最明顯。

進一步的實驗表明：敲除STRN3能夠增強胃癌細胞MST1/2、YAP等基因的磷酸化水平（MST被磷酸化后激活，YAP被磷酸化后失活），對RNA-seq結(jié)果進行分析也提示敲除STRN3后YAP相關(guān)基因低表達。而且，敲除STRN3能夠抑制胃癌細胞生長、增殖，這種抑制效應(yīng)可被過表達YAP所抵消。

結(jié)論：在胃癌細胞中，STRN3是調(diào)節(jié)Hippo通路腫瘤抑制活性的關(guān)鍵分子。

 Figure 1

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STRN3分子致瘤功能的驗證

為了進一步明確STRN3在胃癌發(fā)生過程中的作用，研究者先對其細胞表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)STRN3在胃癌細胞中高表達，且與YAP水平呈正相關(guān)，此結(jié)果在GEO數(shù)據(jù)庫中也得到了驗證。另一方面，對胃癌患者臨床資料進行生存分析，發(fā)現(xiàn)STRN3高表達者預(yù)后較差。

接下來，研究者使用藥物誘導的動物模型繼續(xù)探究STRN3的致瘤效應(yīng)，實驗結(jié)果表明：①藥物誘導時間越長，STRN3、MST1/2、YAP等蛋白的變化越顯著；②敲除STRN3可以抑制腫瘤生長，且敲除越多，抑制效應(yīng)越明顯；③敲除STRN3產(chǎn)生的抑瘤效應(yīng)可被導入YAP所抵消。

結(jié)論：敲除STRN3能夠抑制胃癌發(fā)生，此效應(yīng)主要依靠限制原癌基因YAP的活性。

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STRN3通過充當?shù)鞍坠羌?，促進PP2A對MST1/2的去磷酸化

接下來，研究者旨在探究STRN3和MST1/2之間的具體調(diào)控機制。體外pull down實驗結(jié)果表明：PP2Aa（PP2A的功能亞基）只有在STRN3^CC（STRN3盤尾區(qū)）存在的情況下才能夠與MST2發(fā)生相互作用，出現(xiàn)去磷酸化現(xiàn)象，說明STRN3發(fā)揮的是蛋白骨架的作用（如示意圖Figure 3C）。如果采用結(jié)合位點突變的方法擾亂STRN3與PP2Aa的相互作用，則對MST2的去磷酸化作用消失，相應(yīng)地，也不能夠再調(diào)控下游基因表達及細胞表型。

 Figure 3

 Figure S4

接下來研究者繼續(xù)實驗，找到了STRN3中與PP2Aa結(jié)合的氨基酸序列并命名為STRN3^Core。此段區(qū)域僅僅可以與PP2Aa結(jié)合，并不能招募MST1/2，因此并不能發(fā)揮完整長度STRN3的功能，也即STRN3^Core不能夠引起PP2Aa介導的MST2去磷酸化?；诖朔N結(jié)果，研究者假設(shè)：STRN3^Core可與全長STRN3競爭性結(jié)合PP2Aa，阻止STRN3-PP2A復(fù)合體對MST1/2的失活（如示意圖Figure 4D）。為了驗證此假設(shè)，研究者在腫瘤細胞及動物模型中對STRN3^Core進行過表達操作，觀察到：過表達STRN3^Core能干擾STRN3與PP2Aa結(jié)合，進而促進Hippo通路的抗腫瘤活性。

04

根據(jù)以上實驗結(jié)果設(shè)計干擾STRN3-PP2A相互作用的多肽SHAP

基于STRN3^Core的抗腫瘤效應(yīng)，研究者合成了一段模擬STRN3^Core的多肽——S3C，并發(fā)現(xiàn)其具有與STRN3^Core相似的作用模式及效果。進一步對序列進行縮短、優(yōu)化，研究者找到了具有最佳抑制活性的多肽片段——SHAP，通過實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SHAP可以高效阻斷STRN3-PP2Aa之間的相互作用，增加MST1/2、YAP磷酸化水平，進而抑制YAP下游基因表達，無論是在細胞還是動物中均能起到抑制腫瘤的作用。

 Figure 5

 Figure 6

本文以胃癌中Hippo通路失活為出發(fā)點，首先篩選到了關(guān)閉此通路抑癌活性的關(guān)鍵分子——STRN3。接下來就是對STRN3分子功能的研究：STRN3能通過對MST1/2的去磷酸化作用，進而失活Hippo通路，使YAP磷酸化水平降低、活性增加，進而促癌相關(guān)基因表達增加，促進腫瘤發(fā)生，即：STRN3是一個促瘤分子。在明確STRN3的功能之后，即是探究其發(fā)揮去磷酸化作用的具體機制：通過充當?shù)鞍坠羌?，分別結(jié)合PP2Aa與MST1/2，促進PP2Aa對MST1/2的去磷酸化作用，并基于此設(shè)計了干擾STRN3-PP2Aa結(jié)合的小分子多肽SHAP，起到靶向治療的作用。

從本文中，我們也可以學習到研究蛋白互作（也包括其他分子間相互作用）的基本模式：首先發(fā)現(xiàn)新的分子，明確分子功能；在繼續(xù)研究作用機制時就可以探究其與上下游分子之間的相互作用，然后繼續(xù)研究這種相互作用所介導的功能表型；如果想要繼續(xù)深入探究，就可以尋找分子間結(jié)合片段或結(jié)合位點；最后，就可以根據(jù)結(jié)合關(guān)系設(shè)計靶向治療藥物。這種研究模式不僅僅使用于腫瘤研究，大家在學會之后也可以應(yīng)用到自己所研究的疾病中，從而發(fā)表高分文章。

END