上期文章我們介紹了運(yùn)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組LabelFree技術(shù)研究蛋白互作的背景，接下來我們將分幾期，陸續(xù)給大家介紹具體的研究方法。本期要介紹到的是基于MS強(qiáng)度或計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)依賴法非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白質(zhì)互作分析。

在試驗(yàn)中使用不同的同位素標(biāo)記（某些情況下等壓標(biāo)記）是一種行之有效的肽和蛋白質(zhì)定量方法。通常，分析之前，標(biāo)記樣品和未標(biāo)記樣品是混合在一起的，這時(shí)可以通過測量相應(yīng)的峰值強(qiáng)度來直接確定化合物比率。標(biāo)記大致可以分成這些共價(jià)附著在肽上的標(biāo)記，包括同位素編碼的親和標(biāo)簽、ICAT或iTRAQ、通過酶反應(yīng)合成（例如通過胰蛋白酶合成¹⁸O）或通過代謝合成（例如在細(xì)胞培養(yǎng)中用氨基酸標(biāo)記穩(wěn)定同位素）、SILAC等。在蛋白質(zhì)互作的背景下，標(biāo)記法通常用于識(shí)別非特異性結(jié)合的蛋白，也適用于監(jiān)測調(diào)節(jié)相互作用。總之，基于同位素標(biāo)記的技術(shù)可獲得非常好的分析結(jié)果，但由于分析時(shí)間長以及按比例縮放到與樣本合適的大小的問題等因素限制了此類技術(shù)的應(yīng)用。

非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組LabelFree定量法對所采用的分析方法有不同的要求。從概念上講，光譜計(jì)數(shù)是最簡單的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組LabelFree分析方法。在鑒定實(shí)驗(yàn)（鳥槍實(shí)驗(yàn)）中，單個(gè)肽觸發(fā)的MS/MS事件的數(shù)量可以合計(jì)為圖譜數(shù)，可以在肽和蛋白質(zhì)水平上制成表格。最終，通過比較不同樣品中與該蛋白質(zhì)相關(guān)的所有肽的光譜計(jì)數(shù)來比較樣品中蛋白質(zhì)的相對豐度。 在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互作研究中，光譜計(jì)數(shù)和相關(guān)的方法主要用于區(qū)分真正的相互作用和非特異性結(jié)合蛋白，或者確定不同蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互作的主要差異。  

非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)LabelFree法一般操作流程（圖片來源：百泰派克生物科技）

為了提供可靠的信息，計(jì)數(shù)方法需要一種能夠在高頻下采樣LC峰的儀器，儀器越快，光譜計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的質(zhì)量就越高。光譜計(jì)數(shù)方法也很大程度上受到捕獲方法的影響，特別是那些通過優(yōu)化來限制單個(gè)肽的MS/MS事件數(shù)的方法。最后，由于對峰進(jìn)行了多次取樣，鑒定動(dòng)態(tài)范圍受到限制，低水平離子可能優(yōu)先于高強(qiáng)度離子而丟失，從而限制了光譜計(jì)數(shù)在中等豐度到高豐度蛋白質(zhì)或豐度于樣品之間不斷變化的蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。因此，計(jì)數(shù)方法并不總適用于多種重要的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)相互作用。

本文由百泰派克生物科技整理編輯。

百泰派克生物科技專注于基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)，結(jié)合親和純化與非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組LabelFree、SILAC或SWATH定量技術(shù)，開發(fā)了一系列蛋白質(zhì)組研究策略，其靈敏度高、重復(fù)性好，非常適合蛋白質(zhì)相互作用的研究。

文獻(xiàn)參考：Stephen Tate, Brett Larsen, Ron Bonner, Anne-Claude Gingras, Label-free quantitative proteomics trends for protein-protein interactions. Journal of Proteomics, 2013.