背景介紹

SIRT6能夠以HIF1-a依賴的行為抑制糖酵解，因此可以通過(guò)抑制Warburg效應(yīng)來(lái)發(fā)揮抑制癌癥因子的作用
Warburg effect：正常分化的細(xì)胞主要依靠線粒體的氧化磷酸化為細(xì)胞供能，而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞則依賴有氧糖酵解，這種現(xiàn)象被稱為“Warburg effect”。有氧糖酵解產(chǎn)生的ATP效率很低，但是卻賦予了腫瘤細(xì)胞很多優(yōu)勢(shì)。

禁食增加了循環(huán)中的游離脂肪酸(FFAs)和β-羥基丁酸鹽的水平，可能是由于激活了脂肪分解和生酮。相反，包括支鏈氨基酸(BCAAs)異亮氨酸和纈氨酸在內(nèi)的多種循環(huán)氨基酸在禁食時(shí)減少，可能是由于飲食中AAs的減少。在禁食期間，SIRT1、SIRT6或兩者都過(guò)表達(dá)的小鼠中，這些BCAAs的水平顯著降低。WT小鼠在禁食4至16小時(shí)后血糖水平下降。有趣的是，不是SIRT1而是SIRT6過(guò)表達(dá)抑制了這種反應(yīng)。類(lèi)似的現(xiàn)象在GNG，TCA循環(huán)中也觀察到了。

在禁食期間，年老的SIRT6-tg小鼠的葡萄糖水平與年輕的wt小鼠相似（a)
在禁食期間，SIRT6對(duì)維持血糖正常的作用并不是性別特異性的，在雌性中也有類(lèi)似的結(jié)果（b）
根據(jù)血糖模式，在年老的WT雄性小鼠中，來(lái)自這兩種前體的糖異生能力顯著下降，但在年老的SIRT6-tg雄性小鼠中，糖異生能力維持在與年輕的WT小鼠相似的水平。這種效果與性別無(wú)關(guān)，因?yàn)樵谂灾幸驳玫搅祟?lèi)似的結(jié)果（c,d,e,f)

PCA顯示，性別是大多數(shù)方差(PC1)的原因。此外，在PCA中可以看到顯著的基因型效應(yīng)，其中SIRT6在男性中的作用明顯大于女性(a)
通過(guò)基因集富集分析(GSEA)，我們發(fā)現(xiàn)SIRT6-tg在雄性小鼠中顯著抑制了炎癥通路，而在雌性小鼠中也有類(lèi)似但更溫和的效果,而且在雄性和雌性SIRT6-tg小鼠中，分解代謝途徑的代謝水平均顯著上調(diào)(b)
SIRT6-tg小鼠體內(nèi)脂肪酸β-氧化、TCA循環(huán)、有氧呼吸和AA分解代謝基因表達(dá)顯著增加（c）
對(duì)雄性和雌性轉(zhuǎn)錄組共同的上游調(diào)控因子的分析顯示，PPARα，一個(gè)促進(jìn)肝臟中脂肪酸β氧化的核受體被激活（d)

隨著年齡的增長(zhǎng)，肝臟葡萄糖豐度降低，SIRT6-tg呈升高趨勢(shì)(d)
GNG的中間產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸(G6P)和果糖-6-磷酸(F6P)都隨年齡增長(zhǎng)而增加，但在老年SIRT6-tg小鼠中，它們?nèi)员３衷陬?lèi)似年輕的水平(d)
SIRT6過(guò)表達(dá)抑制了與年齡相關(guān)的枸櫞酸和順式烏頭酸濃度的下降。（e）
肝臟NAD+和FAD水平隨年齡增長(zhǎng)而降低。值得注意的是，SIRT6過(guò)表達(dá)阻止了與年齡相關(guān)的NAD+和FAD的下降（f）

為了進(jìn)一步了解年齡依賴性GNG減少的機(jī)制，我們使用均勻標(biāo)記的13C乳酸鹽進(jìn)行了體內(nèi)穩(wěn)定同位素示蹤（a)
與野生型小鼠相比，以年齡無(wú)關(guān)的方式給予乳酸后，SIRT6-tg小鼠的肝臟葡萄糖豐度更高(b)
在年輕小鼠中，標(biāo)記丙酮酸[M + 3]、TCA循環(huán)代謝物αKG、琥珀酸和蘋(píng)果酸[M + 2]、葡萄糖[M + 2, M + 3]的豐度在基因型之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異(補(bǔ)充圖7d)。有趣的是，在老齡WT小鼠中，標(biāo)記葡萄糖[M + 2到M + 6]的穩(wěn)態(tài)水平，以及最顯著的M + 2和M + 3同位素含量顯著降低，而老齡SIRT6-tg中仍較高(c)
在WT小鼠中，TCA循環(huán)中間體αKG、琥珀酸和蘋(píng)果酸的標(biāo)記值隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著降低，但在SIRT6-tg小鼠中仍然較高(d)
在肝臟中，當(dāng)有過(guò)量的乳酸或在GNG誘導(dǎo)下，乳酸脫氫酶(LDH)催化NAD+依賴的乳酸可逆轉(zhuǎn)化為丙酮酸。隨著年齡的增長(zhǎng)，[U-13C]-乳酸注射后總丙酮酸和丙酮酸M + 3水平顯著降低(e)
年老的SIRT6-tg小鼠中乳酸脫氫酶(LDH)的丙酮酸產(chǎn)量更高，可能是由于較高的NAD+水平(f)
有趣的是，與乳酸相比，丙酮酸的GNG容量在基因型之間沒(méi)有差異（h）

在注射乳酸后，肝臟特異性SIRT6-tg和對(duì)照組小鼠在年輕和年老時(shí)血糖水平相似（a）
肝臟轉(zhuǎn)基因與對(duì)照組小鼠的關(guān)鍵肝臟GNG基因表達(dá)水平相似，肝臟GNG相關(guān)代謝物表達(dá)水平相似，甚至有所降低（b）
在WT小鼠中，GNG前體乳酸和丙酮酸的循環(huán)水平隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，但在SIRT6過(guò)表達(dá)小鼠中沒(méi)有（c）
脂肪組織中關(guān)鍵脂解酶、激素敏感脂肪酶(HSL)的活性磷酸化形式在老年SIRT6-tg小鼠中增加（d）

為了解釋SIRT6如何在生化和分子水平上促進(jìn)健康壽命，以及有多少組織必須過(guò)度表達(dá)SIRT6才能改善健康這些問(wèn)題，該研究追蹤了在近交系C57BL/6JOlaHsd小鼠中SIRT6過(guò)表達(dá)的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
表達(dá)SIRT6而非SIRT1的C57BL/6JOlaHsd雄性和雌性小鼠的壽命明顯長(zhǎng)于野生同窩鼠。SIRT6-tg小鼠保持了類(lèi)似年輕的身體活動(dòng)和代謝靈活性，并減少了與衰老相關(guān)的疾病。老年SIRT6-tg小鼠表現(xiàn)出一種類(lèi)似年輕小鼠的肝臟代謝物圖譜。值得注意的是，SIRT6能夠在有限的能量條件下(如禁食和衰老)產(chǎn)生能量。為了調(diào)節(jié)這一功能，SIRT6促進(jìn)肝臟β-氧化、乳酸和甘油穿梭和肝臟利用、肝臟中NAD+/NADH比值以及脂肪組織中甘油的釋放。這些SIRT6調(diào)控的代謝途徑協(xié)同維持老年期類(lèi)似年輕的TCA周期和GNG活動(dòng)。SIRT6對(duì)健康壽命的積極作用是菌株和性別無(wú)關(guān)的，需要SIRT6調(diào)節(jié)至少兩個(gè)部位的能量生產(chǎn)，肝臟和脂肪組織。
總的來(lái)說(shuō)，SIRT6控制著壽命和在有限的可用時(shí)間(如體育活動(dòng)、禁食和衰老)產(chǎn)生能量的能力。這些信號(hào)通路，以及SIRT6在衰老相關(guān)的關(guān)鍵代謝信號(hào)通路mTOR、IGF-1和AMPK中已知的調(diào)節(jié)作用，使SIRT6成為健康衰老的主要調(diào)節(jié)因子，并作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，以保持功能和延緩衰弱的發(fā)生。

采用標(biāo)準(zhǔn)的甲醇/氯仿萃取方案(樣品:甲醇:氯仿:水::1:4:1:3)，對(duì)6例對(duì)照和6例小鼠組織裂解液進(jìn)行300 μg沉淀，以去除脂質(zhì)和洗滌劑82。蛋白在30 μl濃縮尿素緩沖液(8 M尿素、2 M硫脲、150 mM NaCl (Sigma))中重懸，用50 mM DTT還原36℃1小時(shí)，用100 mM碘乙酰胺在36℃黑暗中烷基化1小時(shí)。將濃縮尿素/蛋白混合物用50 mM碳酸氫銨緩沖液稀釋12倍，用胰酶/LysC混合物(Promega)在36℃下按1:50 (w/w)酶蛋白比消化18 h。采用Agilent 1260生物惰性高效液相色譜系統(tǒng)和餾分收集器，在10個(gè)4.0 mm C18墨盒(Restek, cat# 917450210)上脫鹽蛋白質(zhì)消化液。純化后的肽被快速真空干燥，并在80℃保存，直到進(jìn)一步加工。根據(jù)制造商說(shuō)明，用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT 6plex, Thermo Fisher)標(biāo)記肽(100 μg)。每個(gè)TMT標(biāo)記反應(yīng)包含6個(gè)標(biāo)簽，需要在一次MS運(yùn)行中多路復(fù)用。將6種不同TMT標(biāo)記的多肽組合成一個(gè)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行分離。

采用Agilent 1260生物惰性高效液相色譜系統(tǒng)，3.9 mm 5 mm XBridge BEH Shield RP18 XP VanGuard柱和4.6 mm 250 mm XBridge Peptide BEH C18柱(Waters)進(jìn)行高ph RPLC分離。溶劑組成為:10mm甲酸銨(pH 10)為流動(dòng)相A, 10mm甲酸銨與90% ACN (pH 10)為流動(dòng)相B83。從小鼠肝臟中制備的tmt標(biāo)記多肽用線性有機(jī)梯度(從5%到50% B在80分鐘內(nèi))分離。最初，每次LC運(yùn)行每1分鐘收集80個(gè)餾分。將3個(gè)單獨(dú)的高ph餾分合并為15個(gè)主餾分，每個(gè)主餾分之間間隔15 min(分?jǐn)?shù)1、16、31、46、61 =主餾分1，分?jǐn)?shù)2、17、32、47、62 =主餾分2，以此類(lèi)推)。組合餾分被快速真空干燥，脫鹽，并在80℃保存，直到最終的LC-MS/MS分析。

使用UltiMate 3000納米LC系統(tǒng)與Q Exactive HF質(zhì)譜儀(Thermo Scientific, San Jose, CA)耦合分析純化的肽組分。每個(gè)餾分在35 cm毛細(xì)管柱(3 μm C18 silica, Hamilton, HxSil cat# 79139)上分離，色譜柱ID為150 μm，線性有機(jī)梯度，流速為550 nl/min。流動(dòng)相A和B分別由0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈組成。用Q - Exactive HF質(zhì)譜儀在毛細(xì)管加熱溫度+280℃，噴霧電壓2.5 kV下獲得串聯(lián)質(zhì)譜。完整的MS1光譜在300 ~ 1500 m/z范圍內(nèi)獲得，分辨率為12萬(wàn)，最大積累時(shí)間為50 ms，自動(dòng)增益控制(AGC)設(shè)置為3 106。采用固定第一質(zhì)量為100 m/z的動(dòng)態(tài)m/z范圍獲得了Dd-MS2光譜。MS/MS光譜分辨率為30000，最大積累時(shí)間為155 MS, AGC目標(biāo)設(shè)置為2 105。選取12個(gè)最豐富的離子進(jìn)行破碎，使用30%的標(biāo)準(zhǔn)化高碰撞能量。用40秒的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間對(duì)先前分析的離子進(jìn)行鑒別。

LC-MS分析的原始文件使用MSConvert軟件(ProteoWizard 3.0.6002)轉(zhuǎn)換為mascot generic format (.mgf)，使用Mascot2.4.1和X!Tandem CYCLONE (2010.12.01.1) 針對(duì)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中的SwissProt小鼠序列(2016年版本，添加了115個(gè)已知的污染物蛋白)。以TMT6plex賴氨酸和n端作為氨基甲基半胱氨酸固定修飾和可變修飾、天門(mén)冬酰胺和谷氨酸脫酰胺、賴氨酸和n端氨基?；脱趸鞍彼岬乃阉鲄?shù)。肽質(zhì)量耐量分別為20ppm和0.08 Da，前體和片段離子允許有兩個(gè)缺失的裂解，與儀器質(zhì)量精度一致。Mascot2.4.1和X!Tandem CYCLONE  Scaffold Q + 4.4.6 (Proteome Software, Inc)對(duì)串聯(lián)搜索引擎結(jié)果進(jìn)行分析。采用PeptideProphet和ProteinProphet概率模型計(jì)算多肽和蛋白概率。TMT通道同位素純度也根據(jù)TMT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行校正。
蛋白結(jié)果以蛋白和肽FDR 1%為閾值過(guò)濾，需要至少一個(gè)獨(dú)特的肽段（unique peptide）進(jìn)行蛋白鑒定。那些從單一肽中識(shí)別的蛋白質(zhì)，如果該識(shí)別被多個(gè)搜索引擎(如前所述)確認(rèn)并在所有樣本中識(shí)別，則被包括在進(jìn)一步分析中。從Scaffold中提取報(bào)告離子強(qiáng)度定量值，去除誘餌光譜、污染光譜、多個(gè)蛋白共享的肽譜和缺失通道強(qiáng)度的肽譜(總體<2%缺少量化信號(hào))。然后，通過(guò)對(duì)所有通道中屬于一個(gè)蛋白質(zhì)的所有報(bào)告離子強(qiáng)度的中位數(shù)減去，將log2轉(zhuǎn)換后的相對(duì)豐度歸一化。相對(duì)蛋白質(zhì)豐度是由蛋白質(zhì)組合中所有肽的中位數(shù)來(lái)估計(jì)的。來(lái)自樣品制備的蛋白質(zhì)樣品加載效應(yīng)通過(guò)中值拋光校正，即從所有通道的相對(duì)豐度估計(jì)中減去通道中值，得到中值0。如果被定量到的蛋白質(zhì)有共同的肽段，則將它們聚在一起，并將相應(yīng)的基因名稱分配給每個(gè)蛋白質(zhì)以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)表示。從兩次TMT實(shí)驗(yàn)中得到的每個(gè)蛋白都被擬合到線性模型和經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法來(lái)評(píng)估組間的差異表達(dá)。蛋白質(zhì)顯著性(p值)通過(guò)普通t檢驗(yàn)和中等t檢驗(yàn)計(jì)算。調(diào)節(jié)t統(tǒng)計(jì)量是蛋白的log2表達(dá)量與其標(biāo)準(zhǔn)誤差的比值。計(jì)算各樣本組的對(duì)數(shù)倍表達(dá)變化及p-value <0.05為顯著差異。通過(guò)人工篩選和結(jié)合Uniprot、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行蛋白注釋。使用R編程語(yǔ)言(3.4.0)和Bioconductor上的免費(fèi)庫(kù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析和可視化。
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