基因的時(shí)間開關(guān)

為了研究某個(gè)基因的作用，或者其他目的（如標(biāo)記特定時(shí)段的印記神經(jīng)元），科學(xué)家需要在某一特定時(shí)間打開或關(guān)閉某個(gè)基因的表達(dá)。這就需要一個(gè)靈敏基因開關(guān)。

常用的開關(guān)有兩個(gè)，其一是基于四環(huán)素的TetTag系統(tǒng)，四環(huán)素的存在可啟動(dòng)或阻止位于四環(huán)素操縱子后的基因表達(dá)。（請(qǐng)看：基因的時(shí)間開關(guān)——TetTag系統(tǒng)）

而另一個(gè)常見的基因開關(guān)是CreERT系統(tǒng)。CreERT由三個(gè)關(guān)鍵字Cre、ER、T組合而成，分別對(duì)應(yīng)于CreERT系統(tǒng)中的三個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)：Cre重組酶、雌激素受體（ER，estrogen receptor）和藥物他莫昔芬（T，Tamoxifen）。CreERT系統(tǒng)可被藥物他莫昔芬誘導(dǎo)開啟。

我們一一來拆解CreERT名字里的關(guān)鍵因素。

Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)

Cre是一種識(shí)別特異位點(diǎn)的基因重組酶，Cre酶的基因序列來源于P1噬菌體的環(huán)化重組酶（cyclization recombinase），Cre的名字也源于此。

Cre酶可識(shí)別一段名為L(zhǎng)oxp的特定基因序列。 Loxp序列長(zhǎng)34個(gè)堿基，包括中間8堿基的不對(duì)稱序列，以及兩側(cè)反向回文的13堿基序列。

中間的8堿基決定了Loxp序列的方向，而Loxp序列的方向決定了Cre酶的剪切方式。

通常，Loxp序列會(huì)成對(duì)出現(xiàn)。

如果兩個(gè)Loxp的方向相同，那么，當(dāng)Cre酶結(jié)合兩個(gè)Loxp位點(diǎn)后，會(huì)刪除兩個(gè)Loxp之間的基因序列，以及一個(gè)Loxp序列。

利用這一特性，科學(xué)家設(shè)計(jì)了一個(gè)基因開關(guān)。

在目標(biāo)基因（如下圖中的綠色熒光蛋白GFP）之前，構(gòu)建一段包含兩個(gè)同向的Loxp的基因序列，兩個(gè)Loxp之間是一個(gè)阻止基因轉(zhuǎn)錄的STOP序列。由于STOP序列的存在，綠色熒光蛋白是無(wú)法被轉(zhuǎn)錄翻譯的。當(dāng)Cre酶出現(xiàn)時(shí)，Cre酶會(huì)切除同向Loxp之間的STOP序列。之后，綠色熒光蛋白便會(huì)順利表達(dá)。

這一過程是可逆的。

如果兩個(gè)Loxp序列方向相反，Cre重組酶則會(huì)將兩個(gè)Loxp之間的基因序列反轉(zhuǎn)、左右顛倒。

但這種Cre酶的重組反應(yīng)也是處于動(dòng)態(tài)平衡中的，因?yàn)榉崔D(zhuǎn)后兩個(gè)loxp仍然是反向的，Cre酶可以接著將之反轉(zhuǎn)回去。

為了克服Cre酶重組過程可逆的弱點(diǎn)，科學(xué)家設(shè)計(jì)了另外一種常用的基因開關(guān)序列，DIO序列（double-floxed inverted open reading frame）。

DIO序列中包含兩種類型的Cre酶識(shí)別位點(diǎn)，一種是Loxp，野生型的。另一種是基因突變后的Loxp，如Lox2722。Cre酶的重組反應(yīng)只發(fā)生在同種Loxp位點(diǎn)之間，即只重組兩個(gè)Loxp之間的基因序列，或只重組兩個(gè)Lox2722之間的基因序列。重組不會(huì)在一個(gè)Loxp和Lox2722之間發(fā)生。

兩個(gè)Loxp和兩個(gè)Lox2722的方向都相反，并間隔分布（如下圖）。

兩種loxp之間的序列是目標(biāo)基因，目標(biāo)基因的序列是反向的，無(wú)法表達(dá)出有意義的蛋白質(zhì)。當(dāng)Cre酶出現(xiàn)時(shí)，Cre酶的連續(xù)重組作用最終會(huì)將反向目標(biāo)基因變?yōu)檎颍竽繕?biāo)基因便可正常表達(dá)。

Cre酶的重組過程分為兩步。

第一步是反轉(zhuǎn)。在Cre酶作用下，兩個(gè)方向相反的LoxP之間的序列，會(huì)被反轉(zhuǎn)。反轉(zhuǎn)可能發(fā)生在兩個(gè)LoxP之間，也可能發(fā)生在兩個(gè)Lox2722之間。這兩個(gè)反轉(zhuǎn)無(wú)論誰(shuí)發(fā)生，都不會(huì)影響最后結(jié)果。這一步的重組反應(yīng)是可逆回去的。

反轉(zhuǎn)發(fā)生后，下一步是Cre酶引發(fā)的重組刪除。LoxP引發(fā)的反轉(zhuǎn)會(huì)讓兩個(gè)原本反向的Lox2722變?yōu)橥?，反之亦然。同向的兩個(gè)LoxP或Lox2722位點(diǎn)會(huì)引發(fā)Cre酶的剪切功能。Cre酶會(huì)剪切掉一個(gè)Lox2722和一個(gè)LoxP。最后剩下的一個(gè)LoxP和Lox2722之間不會(huì)再發(fā)生Cre酶的重組，也不會(huì)再逆反回去。它是穩(wěn)定的狀態(tài)。

以上兩種方法是常用的依賴于Cre酶的基因開啟方式。但要想實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間的基因啟動(dòng)，科學(xué)家還需借助其他基因工具。這一工具是雌激素受體。

雌激素受體ER和Cre酶的融合，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的定時(shí)開啟

雌激素受體（ER，estrogen receptor）是雌酮、雌二醇等女性荷爾蒙的細(xì)胞內(nèi)蛋白受體，分為核雌激素受體和膜雌激素受體。

在沒有雌激素的情況下，核雌激素受體跟熱休克蛋白90（HSP90，heat shock protein 90）結(jié)合在一起。由于熱休克蛋白的阻擋，雌激素受體無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核，只能游蕩于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

雌激素出現(xiàn)后，雌激素會(huì)跟核雌激素受體結(jié)合，并將熱休克蛋白90從雌激素受體上排擠走。熱休克蛋白90消失后，雌激素受體便可大搖大擺進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控位于核內(nèi)的基因的表達(dá)。

科學(xué)家通過基因編輯，將雌激素受體的配體結(jié)合域和Cre酶融合在一起。這樣一來，沒有雌激素時(shí)，Cre酶、雌激素受體配體結(jié)合域和熱休克蛋白綁定在一起，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)飄散。Cre酶無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)目標(biāo)基因表達(dá)。當(dāng)雌激素出現(xiàn)時(shí)，熱休克蛋白被排擠掉，Cre酶和雌激素受體的結(jié)合體蛋白便可進(jìn)入細(xì)胞核，Cre酶也就可以發(fā)揮作用。

科學(xué)家為了排除內(nèi)源雌激素的影響，突變了雌激素受體。突變后的雌激素受體不再結(jié)合體內(nèi)的雌激素，只對(duì)他莫昔芬這種外源藥物有親和力。也就是說，只有當(dāng)他莫昔芬出現(xiàn)時(shí)，Cre酶才能入核調(diào)控基因表達(dá)。同時(shí)，由于與Cre酶融合的只是雌激素受體的配體結(jié)合域，因此不會(huì)觸發(fā)雌激素受體相應(yīng)的基因調(diào)控。

總結(jié)

當(dāng)科學(xué)家需要開啟Cre酶介導(dǎo)的目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)，只需將外源藥物他莫昔芬可通過口服或注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)即可。

CreERT系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的時(shí)間控制，在時(shí)間要求精準(zhǔn)的科學(xué)研究中大放異彩。例如，在記憶的研究中，CreERT系統(tǒng)（或TetTag系統(tǒng)），和即刻早期基因一起，經(jīng)常作為基因表達(dá)的時(shí)間開關(guān)，特異地標(biāo)記出只參與某一段記憶的神經(jīng)元。