ZmFBL41的自然變異賦予玉米紋枯病抗性

題目：Natural variation in ZmFBL41 confers banded leaf and sheath blight resistance in maize

期刊：Nature Genetics

作者及第一單位：Ning Li, et al, Zhaohui Chu (山東農(nóng)業(yè)大學(xué))

DOI：https:///10.1038/s41588-019-0503-y

研究背景

玉米紋枯病是由壞死性真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)所引起的重要病害。研究表明紋枯病抗性是由多基因控制的數(shù)量性狀，且未發(fā)現(xiàn)有主效基因存在。目前，雖然有很多抗性相關(guān)的QTLs和防御相關(guān)的基因被鑒定，但是對(duì)立枯絲核菌病原菌的認(rèn)識(shí)較少，且玉米和水稻抗紋枯病的機(jī)理尚不清楚。

材料和方法

材料：318份自交系群體（133份熱帶/亞熱帶起源自交系、78份溫帶起源自交系和71份混合起源自交系）

處理方式及性狀鑒定：隨機(jī)選取10株接紋枯病病原菌，5天后測(cè)量病變長度

研究結(jié)果

1、 玉米自交系紋枯病抗性的GWAS分析

自然變異群體中的病變長度出現(xiàn)差異，且熱帶/亞熱帶起源自交系的更強(qiáng)的紋枯病抗性。利用542438個(gè)SNP進(jìn)行紋枯病抗性的GWAS分析，鑒定到28個(gè)紋枯病抗性關(guān)聯(lián)SNP，這些SNP對(duì)應(yīng)9個(gè)位于1、4、7和8號(hào)染色體的基因座。

(a)    不同自交系群體在接種紋枯病后的病變長度 (b) 不同起源的自交系群體的病變長度

(a) GWAS的曼哈頓圖 (b) ZmFBL41區(qū)域的局部曼哈頓圖

關(guān)聯(lián)最顯著的SNP位于4號(hào)染色體GRMZM2G109140的第二外顯子，GRMZM2G109140為假定的分子量為41KDa的F-Box蛋白，命名為ZmFBL41。ZmFBL41定位在細(xì)胞質(zhì)。對(duì)23個(gè)抗性自交系（RH）和28個(gè)敏感自交系（SH）的ZmFBL41測(cè)序發(fā)現(xiàn)，4個(gè)位于ZmFBL41第二外顯子的SNP與紋枯病抗性連鎖。

51個(gè)自交系可以分為兩個(gè)單倍型：ZmFBL41^B73和ZmFBL41^Chang7-2，且ZmFBL41^B73和紋枯病敏感型呈線性相關(guān)。對(duì)20個(gè)SH和17個(gè)RH的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RH和SH之間的表達(dá)量差異不顯著，表明ZmFBL41 的單倍型的抗病和感病與表達(dá)量無關(guān)。

(a)基于ZmFBL41的連鎖作圖和不平衡分析 (b)玉米自然變異群體的單倍型 (c)抗性自交系和感性自交系的ZmFBL41的表達(dá)分析比對(duì)

2、 ZmFBL41^B73是玉米紋枯病的負(fù)調(diào)控因子

轉(zhuǎn)座子插入突變體Zmfbl41中的ZmFBL41表達(dá)量下降，且抗病能力增強(qiáng)，抗病相關(guān)基因ZmPR4和ZmPR10的表達(dá)量升高。在水稻中異源過表達(dá)ZmFBL41^B73的抗病能力下降，抗病相關(guān)基因ZmPR4和ZmPR10的表達(dá)量降低。

(a)轉(zhuǎn)座子插入突變體Zmfbl41的紋枯病抗性鑒定 (b) 轉(zhuǎn)座子插入突變體Zmfbl41的抗性基因表達(dá) (c)水稻異源過表達(dá)ZmFBL41^B73植株對(duì)紋枯病敏感

3、 ZmFBL41^B73與ZmCAD互作，促進(jìn)ZmCAD的泛素化降解

利用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞提取物中ZmCAD的降解程度，發(fā)現(xiàn)ZmCAD蛋白能夠被ZmFBL41^B73介導(dǎo)的26S蛋白酶體降解。當(dāng)?shù)鞍酌阁w的活性被抑制時(shí)，ZmCAD蛋白更加穩(wěn)定，且ZmCAD蛋白的降解部分依賴于ZmFBL41^B73。

(a、b、c) ZmFBL41^B7通過LRR結(jié)構(gòu)域與ZmCAD 互作 (d) ZmCAD 的降解依賴于26S蛋白酶體(無細(xì)胞降解實(shí)驗(yàn)) (e) zmfbl41突變體的細(xì)胞提取物的降解速度更慢 (f) MG132處理抑制ZmFBL41^B37誘導(dǎo)的ZmCAD降解。

4、 ZmCAD通過調(diào)控木質(zhì)素合成途徑正調(diào)控作玉米紋枯病抗性

玉米轉(zhuǎn)座子插入突變體zmcad的紋枯病抗性降低，且相關(guān)基因ZmPR4和ZmPR10的表達(dá)量降低。水稻ZmCAD同源基因OsCAD8B敲除株系的株高降低，木質(zhì)素含量下降，抗紋枯病能力下降。這表明ZmCAD和OsCAD8B時(shí)紋枯病抗性的正調(diào)控因子。

通過測(cè)量10個(gè)抗病自交系和12個(gè)敏感性自交系侵染48h后的木質(zhì)素含量發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素在所有自交系中均先上升后降低，但抗病自交系的木質(zhì)素含量更高。此外，zmfbl41和zmcad 突變體的木質(zhì)素低于野生型。敲除ZmCAD后木質(zhì)素合成途徑并沒有完全阻斷，且玉米中存在12個(gè)CAD基因，CADs之間這表明可能存在功能冗余。

(a)    zmcad 轉(zhuǎn)座子插入突變體的抗病能力下降 (b) zmcad 轉(zhuǎn)座子插入突變體抗性相關(guān)基因表達(dá)降低 (c) OsCAD8B 敲除株的抗病能力下降 (d) 10個(gè)抗病自交系和12個(gè)敏感性自交系的木質(zhì)素含量。(e), zmfbl41和zmcad 突變體的木質(zhì)素含量測(cè)定。

5、 ZmFBL41^B73的自然變異阻礙ZmFBL41^B73與ZmCAD的互作

通過點(diǎn)突變獲得ZmFBL41^B73LRR(E214G),ZmFBL41^B73LRR(S217R)和ZmFBL41^B73LRR (E214G/S217R)突變體，用Y2H驗(yàn)證是否與ZmCAD互作。ZmFBL41^B73LRR(E214G) 和ZmFBL41^B73LRR(S217R)仍然與ZmCAD互作，但ZmFBL41^B73LRR(E214G/S217R) 和ZmFBL41^Chang7-2LRR不能與ZmCAD互作。這表明LRR結(jié)構(gòu)域突變能妨礙ZmFBL41^Chang7-2和ZmCAD互作。

玉米細(xì)胞提取物的降解實(shí)驗(yàn)和煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)降解實(shí)驗(yàn)表明ZmFBL41^Chang7-2由于LRR結(jié)構(gòu)域的E214和S217突變導(dǎo)致不能與ZmCAD互作，ZmCAD積累。

(a) LRR結(jié)構(gòu)域突變阻礙ZmFBL41^Chang7-2和ZmCAD互作。 (b) ZmFBL41^Chang7-2細(xì)胞提取物中ZmCAD的穩(wěn)定性 (c) ZmFBL41^Chang7-2不能促進(jìn)ZmCAD的降解 (d) ZmFBL41^B37的單個(gè)氨基酸替換不影響ZmCAD的降解

小結(jié)

敏感型玉米品種在紋枯病菌侵染早期，ZmFBL41與SKP1互作形成SCF^FBL41 復(fù)合體，招募ZmCAD蛋白被26S泛素化降解，ZmCAD蛋白含量降低，使得木質(zhì)素合成減少，細(xì)胞壁防御強(qiáng)度下降，最終被紋枯病菌侵染。而抗性品種中ZmCAD蛋白不能與復(fù)合體互作使得抗紋枯病能力增強(qiáng)。