真核生物細胞的一個主要特征是通過細胞的區(qū)域化（cellular compartmentalization）來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)行使各種基礎生命活動的化學過程，進而提高特異性及其效率，主要包括有膜細胞器（membrane bound）和無膜細胞器（membraneless organelles）兩大類。已知的無膜細胞器中除了部分（signalsomes）參與細胞信號傳導之外，大部分介導的是RNA的代謝并維持其穩(wěn)態(tài)，也被稱為RNA 顆粒（RNP granules），廣泛分布于細胞核（核仁，Cajal小體，PML小體）以及細胞質(zhì)內(nèi)（如 p body, stress granule, 神經(jīng)內(nèi)的RNA轉運顆粒等 ）。

2009年Clifford P. Brangwynne等人在首次將相分離的概念應用到生物系統(tǒng)，來解釋線蟲發(fā)育中P顆粒的不對稱部分。隨后的研究認為，RNP顆粒的形成是一個RNA和RNA結合蛋白（RBP）液-液性分離（liquid-liquid phase separation）的過程，起初均勻分布的RNA-蛋白溶液發(fā)生相分離形成RNA-蛋白濃度較高的聚集相（condensed phase）以及之外的可溶相（soluble phase）。在聚集相之中，RNA和RBP高度濃縮，表現(xiàn)出液滴（liquid-like）的性質(zhì)，類似于一個獨立的細胞器。無膜細胞器的組分往往存在濃縮相與可溶相之間的分子動態(tài)平衡（dynamic equilibrium）。不同聚集體組分各不相同，但他們的核心組成蛋白在結構上都很相似，包括結構化的寡聚結構域(Oligomerization)、固有的無序區(qū)（Intrinsically disorder region, IDR）和底物結合區(qū)(substrate binding domain, SBD)。以應激顆粒SG（Stress Granules）為例，細胞在是當細胞受到各種環(huán)境和內(nèi)在脅迫（stress）條件下，多聚核糖體解聚并釋放大量的mRNA，進而形成大量的無膜RNA-蛋白質(zhì)聚集體，即應激顆粒。應激顆粒的一個核心組分是G3BP蛋白，由二聚化結構域NTF2、兩個無序區(qū)（IDR1/2）及RNA結合域（RRM/RGG）構成。

然而，單一核心蛋白的相變和RNP顆粒的形成之間的關系并不清楚。此外，每一類聚集體都有自己的特異性，包括分子組成、物理特性、表面張力等的各不不同，其各自形成及如何共存的調(diào)控機制也都尚待研究。

2020年4月16日，Cell雜志背靠背發(fā)表的三篇文章以G3BP調(diào)控應激顆粒SG形成為例，解析了核心蛋白的相變?nèi)绾握{(diào)控RNP聚集體的形成，并且提出了競爭性結合的蛋白互作網(wǎng)絡以解釋多種聚集體形成及共存的新模型。

第一篇文章來自St. Jude Children’s Research Hospital的J. Paul Taylor組，題目為G3BP1 Is a Tunable Switch that Triggers Phase Separation to Assemble Stress Granules。楊培國博士等人首次在全基因組范圍內(nèi)篩選出了調(diào)控SG形成的重要蛋白組分，系統(tǒng)的研究了參與SG形成的蛋白網(wǎng)絡以及重要組分在其形成中的作用。該研究發(fā)現(xiàn)SG的形成起始于一個包括G3BP1蛋白在內(nèi)的核心SG網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡由蛋白-蛋白、蛋白-RNA、RNA-RNA相互作用交織而成。當相互協(xié)同作用（cooperative interactions）發(fā)生的時候，G3BP1復合體誘導相分離的發(fā)生從而組裝成應激顆粒（SG）。

首先，他們通過對人類全基因組21,121個基因的RNAi篩選，鑒定了210個影響SG組裝的蛋白，通過與之前Roy Parker小組發(fā)表的SG組成成分以及相關數(shù)據(jù)庫的比對，發(fā)現(xiàn)了一個含有36個蛋白的核心SG網(wǎng)絡。該網(wǎng)絡中G3BP1/2占據(jù)核心位置。進一步采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對這36個蛋白逐一敲除發(fā)現(xiàn)，只有G3BP1/2雙敲之后能夠能夠完全抑制SG的形成，進一步證明了G3BP1/2的重要性。鑒于G3BP1和G3BP2的高度相似性，他們以G3BP1為例，通過體外實驗檢測其相變的調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)G3BP1本身在生理鹽濃度下并不發(fā)生相分離，而RNA可以促進其相分離。mRNA以及單鏈RNA可以促進G3BP1相分離，而tRNA或者雙鏈RNA并不能。RNA的長度也起到作用，小于250nt的RNA基本不再促進相分離。

隨后，他們通過構建蛋白截短體（Truncation）的方式鑒定出G3BP1的N-端NTF2結構域和C-端RNA結合區(qū)域（RBD）分別是SG和相分離所必須的，中間的非折疊區(qū)域（IDR）反而是不必須的，與之前一直以來認為IDR主要參與了相分離不同。同時，他們通過RBD互換（swap）的方法探討了RNA結合價位、結合位點和結合力（affinity）的的問題，發(fā)現(xiàn)多價位的RNA結合（2xKH/3xKH）是必須的（multivalency），而且G3BP1的RBD可以被具有該屬性的其他RBD所替換來組裝SG。而將G3BP的NTF2結構域替換成其他的二聚體結構域發(fā)現(xiàn)，GST以及FKBP(F36M)等二聚體也可以行使類似的功能，但是其組裝SG的能力不同，說明NTF2結構域可能通過與其他SG蛋白組分（如Caprin1）相互作用進而調(diào)控G3BP1的相分離。Caprin1是G3BP1核心網(wǎng)絡的成員之一，對SG的形成是非必須的。而Caprin1可以大大的促進G3BP1的相分離。在細胞內(nèi)過表達Caprin1可以降低細胞形成SG所需的G3BP的閾值濃度（threshold concentration）。

最后，他們研究了中間IDR域?qū)τ赟G形成的調(diào)控功能。雖然IDR對于SG的形成不是必不可少的，但是該研究發(fā)現(xiàn)IDR可以調(diào)節(jié)G3BP1在細胞的可溶性（solubility），缺失IDR的G3BP1組裝的SG在FRAP實驗中恢復更慢；通過共聚焦顯微鏡定量SG組分的分離系數(shù)（partition coefficient）以及APEX2介導的proximity labeling都顯示IDR可以調(diào)控部分蛋白被募集到SG的能力。G3BP1含有酸性IDR1區(qū)域，缺失實驗分析表明其具有抑制SG形成的能力，且這種能力與氨基酸序列無關。E-Q的突變體表明電荷性質(zhì)決定了這種抑制功能。此外，已有的研究就G3BP1的磷酸化對 SG組裝過程的影響尚存在爭議，本研究中發(fā)現(xiàn)G3BP1 S149磷酸化的mimetic（S149E）極大的降低了其相分離的能力。S149E仍舊能在細胞內(nèi)組裝SG，但是所需的閾值濃度大大提高，證明G3BP1的S149位的磷酸化在一定程度上調(diào)控了SG的組裝過程。

楊培國博士等人的研究揭示了以G3BP蛋白為核心蛋白互作網(wǎng)絡及其介導的的SG組裝的分子機制。更為重要的是，他們通過扎實的生化實驗解析了G3BP蛋白各個結構與在其相變及SG組裝過程中的調(diào)控功能，發(fā)現(xiàn)IDR之間能夠發(fā)生分子內(nèi)以及分子間的相互作用，而RNA的結合和S149位的磷酸化可以調(diào)節(jié)這三者之間的相互作用，從而起到像開關一樣的機制來調(diào)節(jié)相分離和SG組裝。

第二篇文章來自Clifford P. Brangwynne博士課題組，題目為Competing Protein-RNA Interaction Networks Control Multiphase Intracellular Organization。David W. Sanders博士等人同樣研究了G3BP蛋白介導的SG組裝分子機制，并且分析了不同G3BP蛋白不同結構域?qū)G組裝的影響，得到了很類似的結論，即NTF2結構域和RBD結構域是必不可少的，而IDR1/2的雙缺失的G3BP依舊可以介導SG的組裝過程，但是單獨缺失IDR2結構域的G3BP蛋白失去介導SG組裝的功能。同時，他們也發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的多價位結合對于SG的組裝至關重要。

不一樣的是，David W. Sanders博士等人的研究除了分析G3BP蛋白之外，還借助于他們組之前發(fā)表的Corelets系統(tǒng)詳盡地研究了與G3BP蛋白互作的其他蛋白在SG組裝過程中的功能。該系統(tǒng)主要分為兩個部分，第一部分中的iLID可以在藍光下與第二部分的SspB結合，而FTH1則可以自組裝成為24寡聚體。GFP與mCherry可以作為報告系統(tǒng)。

通過構建帶有mcherry的NTF2-Corelet同時過表達帶有GFP的SG及P小體蛋白組分，發(fā)現(xiàn)共有8個蛋白聚集在NTF2的聚集體中，而免疫共沉淀實驗（IP）則鑒定出其中三個蛋白與NTF2具有很強的親和性，包括USP10/CAPRIN1/UBAP2L。G3BP的S38F突變體（不能與CAPRIN1/UBAP2L相互作用）不能形成聚集體，而F33W（不能與CAPRIN1/USP10相互作用）則沒有顯著影響，說明G3BP與UBAP2L的相互作用對其相變具有決定性作用。與其他兩個蛋白不一樣的是，USP10并不具有RNA結合域，因此不能提供多價的結合位點。他們發(fā)現(xiàn)USP10與NTF2的相互作用會掩蓋其結合價位（Valence capping），而非影響其二聚化，進而負調(diào)控SG的組裝過程。

與第一篇文章類似，他們也發(fā)現(xiàn)了高價的RBD與多聚體釋放的RNA流（RNA influx）對于SG的形成至關重要。此外，他們還同時分析了P小體的標志物，并且發(fā)現(xiàn)在應激條件下，SG常與P小體具有共定位效應，說明不同的聚集體之間的共存與相互調(diào)節(jié)關系。而在G3BP雙敲除的細胞系中過表達UBAP2L或者FXR1都能夠恢復SG的組裝過程，說明他們可以獨立于G3BP蛋白而形成自己的組裝節(jié)點（Node）。而UBAP2L能夠與G3BP和FXR1結合，但是不能同時結合兩者，提示G3BP和FXR1競爭性地結合UBAP2L。細胞中G3BP/FXR1的比例過高則可能抑制SG形成，而在G3BP雙敲細胞中過表達UBAP2L得到的聚集體中既有SG的標志物，也有P小體的標志物。因此，他們構建了一個同時涉及SG和P小體組裝的蛋白互作網(wǎng)絡，并且認為蛋白之間的競爭性結合對于多相共存（multiphase co-existence）至關重要。實驗結果也證實同時過表達遠端的蛋白組分（親SG的G3BP與親P小體的DCP1A）能夠促使兩者分開。

總之，該研究不僅解析了G3BP蛋白各結構域在SG形成中的關鍵功能，還通過蛋白互作網(wǎng)絡提出了相分離及多相共存的新的模型。他們認為正常情況下，不同聚集體（如SG/P小體）之間各自存在組裝節(jié)點，且共享的蛋白組分可以作為連接的橋梁，是兩者共存且存在一定的共定位效應。而引入飽和的帽蓋蛋白（cap protein）來封閉連接兩組分之間的橋梁會促使兩個聚集體分離。然而，如果帽蓋蛋白封閉了其中某組分的組裝節(jié)點或者清除其底物（如RNA）則會直接抑制該聚集體的形成，而使另一聚集體單獨存在。

第三篇文章來自Titus M. Franzmann博士課題組，題目為RNA-Induced Conformational Switching and Clustering of G3BP Drive Stress Granule Assembly by Condensation。該研究主要采用了一系列生化實驗對G3BP進行研究，同樣發(fā)現(xiàn)了其各結構域功能。與第一篇文章類似，他們也發(fā)現(xiàn)了IDR區(qū)域可以通過變構效應來抑制G3BP蛋白功能，進而抑制SG的組裝過程。此處就不再做詳細介紹。

總之，這三篇文章通過不同的實驗手段，從不同角度共同闡述了G3BP調(diào)節(jié)SG形成的分子機制，揭示了單一蛋白的相變?nèi)绾握{(diào)控多組分RNP聚集體的形成，對于細胞內(nèi)其他的無膜細胞器的形成具有重大啟示意義。同時，這些研究也為各無膜細胞器之間的共存及互相調(diào)控提供了新的模型及研究思路。

另外，這也是繼2018年Cell（Volume 173 Issue 3）同時報道4篇相分離相關的文章后（詳見BioArt報道：李丕龍教授特評丨生物大分子的“相變”——簡談近期系列“相變”研究成果），再一次同時報道了3篇相分離的文章。

原文鏈接：

https:///10.1016/j.cell.2020.03.046

https:///10.1016/j.cell.2020.03.050

https:///10.1016/j.cell.2020.03.049