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編譯丨QY、赤貞 責(zé)編丨迦溆 圖片引自：https://www. 細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，細(xì)胞內(nèi)的各種組分如何在正確的時間以及空間上聚集以執(zhí)行其相應(yīng)的功能，是細(xì)胞在一系列基本的生命活動中需要解決的問題。為此，細(xì)胞進(jìn)化出了一系列的細(xì)胞器，包括有膜包裹的（比如線粒體，細(xì)胞核，溶酶體等）和無膜包裹的細(xì)胞器（核仁等）。有膜包裹的細(xì)胞器將特定蛋白、核酸等物質(zhì)包裹起來，以在特定的空間內(nèi)執(zhí)行其功能，如果這些蛋白或者核酸脫離特定的位置，將導(dǎo)致嚴(yán)重的后果（比如，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)，將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，核酸釋放到細(xì)胞質(zhì)，將導(dǎo)致innate immune signaling pathway 的激活）。另一類無膜包裹的細(xì)胞器是如何形成，以及其物理化學(xué)本質(zhì)，是困擾了大家多年的問題。 Hyman和Brangwynne 2009年在Science發(fā)表了題為：Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation 的文章【1】，提出了細(xì)胞內(nèi)通過“相分離”，可以提供一種特定的方式讓細(xì)胞內(nèi)的特定分子聚集起來，從而在“混亂的”細(xì)胞內(nèi)部形成一定“秩序”，為困擾了大家多年的問題，提供了全新的思路。近幾年的研究表明，液-液相分離（LLPS：liquid-liquid phase separation）可能是細(xì)胞形成無膜細(xì)胞器的物理化學(xué)基礎(chǔ),比如細(xì)胞內(nèi)的p granule, nucleolar, stress granule等（圖1）。 圖1：細(xì)胞的的相分離結(jié)構(gòu)。（引自參考文獻(xiàn)【2】） LLPS也被報(bào)道在一些疾病（如：癌癥，以及神經(jīng)退行性疾病等）的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。相分離領(lǐng)域已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，相關(guān)的文章近年來呈現(xiàn)井噴似的增長（見文末的延伸閱讀：Bioart 系列解讀）。（另外，Brangwynne在iBiology上面有三期的講座，對這個領(lǐng)域的歷史，以及其實(shí)驗(yàn)室相關(guān)的此方面的開創(chuàng)性工作做了非常具體的介紹，題目為：Liquid Phase Separation in Living Cells。鏈接：https://www./biophysics/liquid-phase-separation-in-living-cells/ ） Cliff Brangwynne (Princeton & HHMI)在iBiology上的介紹相分離研究 然而，像許多新興的研究領(lǐng)域一樣，該領(lǐng)域的研究對于實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，以及實(shí)驗(yàn)方法還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)的指南，對于該領(lǐng)域的研究造成了一定的困擾，亟需建立一個從理論體系到具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。近日Simon Alberti, Amy Gladfelter, 和 Tanja Mittag聯(lián)合在Cell 雜志發(fā)表了題為：Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates的文章，較為系統(tǒng)地闡述了LLPS相關(guān)的理論基礎(chǔ)，提出了LLPS的體內(nèi)體外的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的具體指南。 相分離具體的作用可以參考另一篇由Hyman以及Michael Rosen執(zhí)筆的發(fā)表在Nature reviews molecular cell biocology上的題為 Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry的文章，這篇文章更加系統(tǒng)的介紹了相分離的原理，以及其目前所報(bào)道的生物學(xué)功能【2】。另外，Simon Alberti等人在2018年，發(fā)表了另一篇題為A User’s Guide for Phase Separation Assays with Purified Proteins，非常細(xì)致地闡述了體外相分離實(shí)驗(yàn)的純化蛋白的考慮以及一些相關(guān)的tips【3】。建議讀者在具體的實(shí)驗(yàn)中可以參考此文章。這篇Cell文章更傾向于整體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指南，為相關(guān)領(lǐng)域的研究提出一些標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)步驟，也提出了一些這個領(lǐng)域還需要進(jìn)一步闡述的機(jī)制，以及相分離的研究的根本目的，即要研究其生物學(xué)的具體功能。 相分離的基本概念，相分離的形式，以及如何預(yù)測一個蛋白是否會形成相分離現(xiàn)象 LLPS的發(fā)生，高度依賴溶液中生物大分子（比如：蛋白，DNA以及RNA等）的濃度、物理化學(xué)性質(zhì)，以及溶液所處的環(huán)境，比如：溫度、pH、鹽離子濃度、鹽離子類型以及溶液中存在其它的生物大分子。作者使用如下的Phase Diagram來描述這些與相分離相關(guān)的條件與該溶液是否發(fā)生相分離的關(guān)系（圖2）。 圖2：Schematic Phase Diagram 簡單來講：當(dāng)溶液中所處的大分子濃度低于一個特定的值c時，這一體系無論在什么樣的溫度，pH等條件下都不能發(fā)生相分離。當(dāng)高于這一濃度后，在合適的pH以及溫度等條件下，就能形成相分離現(xiàn)象，形成相分離后，該生物大分子便有兩種存在形式，一種是在溶液中的低濃度狀態(tài)，一種是形成的“液滴”中較高濃度的形式存在。隨著相關(guān)條件的變化，兩種形式可以相互轉(zhuǎn)化。也就是說，相分離是一種高度動態(tài)的過程。 另外，LLPS不僅能形成液滴狀的結(jié)構(gòu)，還能繼續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀物的形式。凝膠狀態(tài)的相分離經(jīng)常不可逆轉(zhuǎn)，這也為阿爾茲海默癥等體內(nèi)形成的amyloid-like fibers的形成，提供了全新的思路，為相關(guān)藥物的設(shè)計(jì)提供了全新的理念。已有研究表明一些蛋白的突變會加快這種LLPS向凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)化的過程。 液-液相分離的發(fā)生是蛋白質(zhì)和核酸在某種特定的情況下的一個普遍特性，然而多數(shù)相分離根本不可能發(fā)生在一個正常的細(xì)胞中。正如僅有一小部分蛋白質(zhì)能夠在生理狀態(tài)下發(fā)生淀粉樣改變那樣，僅有一小部分蛋白質(zhì)的序列具有在活細(xì)胞內(nèi)形成相分離的能力。截至目前為止，我們對控制相分離的基因?qū)W及生物學(xué)特性仍所知甚少。因此，在斷定相分離的發(fā)生時，我們應(yīng)該尤其謹(jǐn)慎。 近幾年涌現(xiàn)了許多對在生理狀態(tài)下能夠發(fā)生相分離的分子的普遍特征的研究。其中之一即是支架及客戶蛋白的理論。支架分子被認(rèn)為是相分離的驅(qū)動分子，而在相分離形成以后參與到液滴當(dāng)中的則被稱為是客戶蛋白。支架蛋白與客戶蛋白的相分離需要一個互作網(wǎng)絡(luò)的形成，該網(wǎng)絡(luò)常由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作及蛋白質(zhì)-RNA互作構(gòu)成。
兩種蛋白質(zhì)類型參與促進(jìn)此類互作網(wǎng)絡(luò)的形成：一類以多個折疊的結(jié)構(gòu)域?yàn)樘攸c(diǎn)，如Nck蛋白中的SH3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠與短的線性模塊如SLiMs相結(jié)合；另一類蛋白則以內(nèi)部無序區(qū)（IDR）為特點(diǎn)。兩類蛋白有多處相似，其中最重要的一點(diǎn)是：蛋白間都通過多個結(jié)構(gòu)域或模塊相互作用。因此，通過從基因上初步推斷蛋白的化合價可以判斷該蛋白形成相分離的能力及飽和濃度。對RNA而言，特定的RNA可驅(qū)動相分離的發(fā)生，而一些含有IDR的蛋白包含多個RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、其目的RNA也包含多個蛋白結(jié)合序列。因此，蛋白和RNA能夠通過多種方式形成多價互作，這些互作決定著特定蛋白及核酸形成相分離的能力。 多價的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)如何發(fā)生相分離這一問題，可以從高分辨率的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)中得到結(jié)果。然而，IDR是如何驅(qū)動相分離的則相對不那么容易理解。
IDR是相分離蛋白中一種常見的結(jié)構(gòu)域，常常不含有芳香族及脂肪族氨基酸，且不能夠形成一個相對能量較低的、單一的折疊結(jié)構(gòu)。相反，這些蛋白的構(gòu)象能量往往與其一級序列所含有的能量相同。一級序列往往決定了這些蛋白的相變能力、相變的驅(qū)動因素、相變的臨界濃度及黏彈性。能夠影響相分離的序列特征包括IDR的長度、數(shù)量、模式、及IDR與IDR間序列的特征。典型的決定因素包括疏水性氨基酸的組成、模式等。盡管IDR中疏水性氨基酸的含量相對較少，他們代表了相分離中的粘附成分、并根據(jù)溫度變化調(diào)控相分離的濃度。帶電氨基酸也能夠影響相分離的形成，成對的、帶相反電荷的蛋白能夠以復(fù)合凝聚的形式形成沉淀。
IDR的另一個共同特征是由低復(fù)雜度序列區(qū)（LCR）構(gòu)成，如單一氨基酸的重復(fù)序列。一個典型的LCR是朊病毒樣LCR，富含極性氨基酸如絲氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺，不含有帶電氨基酸。另一個典型的LCR是RNA結(jié)合蛋白中常見的RGG結(jié)構(gòu)域，富含精氨酸，且能夠調(diào)控LCR/RNA間的相互作用。LCR間相互作用的基礎(chǔ)是電荷-電荷、共軛-共軛、陽離子-共軛互作。
因此，目前常應(yīng)用預(yù)測算法推測蛋白質(zhì)中的IDR以分析其發(fā)生相分離的能力（圖3）。 圖3：蛋白序列分析以及相分離預(yù)測工具 以FUS為例，IUPred算法鑒定前250個氨基酸、aa365-420、aa450-C端為潛在IDR，PLAAC算法鑒定到FUS N端含有QGSY-及G-重復(fù)序列，D2P2算法則區(qū)別了FUS的可折疊結(jié)構(gòu)域與無序結(jié)構(gòu)域。Anthony A. Hyman教授的團(tuán)隊(duì)則對這一預(yù)測算法的結(jié)果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 體外重構(gòu)相分離 相分離可以在體外通過純化的蛋白以及核酸等在特定的條件下發(fā)生，體外重構(gòu)的相分離實(shí)驗(yàn)對于該領(lǐng)域具有重要的作用（2012年，美國西南醫(yī)學(xué)中心Michael Rosen和Steven McKnight獨(dú)立發(fā)現(xiàn)在試管中這些分子通過微弱的作用力形成液滴，即首次證實(shí)了相分離能夠通過簡單的生化實(shí)驗(yàn)在體外重復(fù)【4, 5】。清華大學(xué)李丕龍教授便是Michael Rosen 這篇文章的一作）。 體外的相分離現(xiàn)象可以非常簡單的使用普通的光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)生相分離的特點(diǎn)是溶液會從澄清變得渾濁，鏡檢時會看到在溶液中會存在一些如水中的油滴狀態(tài)的液滴。作者建議使用PEG或者lipids包被載玻片，以更好的觀察和記錄相分離現(xiàn)象。另外，可以將蛋白或者RNA使用熒光標(biāo)記，或者將不同的組分通過不同的熒光分開標(biāo)記，以方便使用熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡拍攝出更好的圖片，同時可以做FRAP等實(shí)驗(yàn)，以及持續(xù)拍攝獲得LLPS動態(tài)變化過程。但是在具體應(yīng)用此方法的時候要注意，一些RNA與RNA結(jié)合蛋白之間可能會被拍攝中的激光照射所交聯(lián)，在拍攝的時候需要注意此類問題。 除此以外，可以使用檢測溶液渾濁度的方法檢測相分離，也可以使用離心沉淀的方法檢測相分離現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)相關(guān)的具體的細(xì)節(jié)，推薦大家閱讀香港科技大學(xué)張明杰教授題為Cell Phase transition in postsynaptic densities underlies formation of synaptic complexes and synaptic plasticity 的Cell文章中圖4中的實(shí)驗(yàn)【6】。（另：Bioart專門邀請了張明杰教授過去的博士，現(xiàn)為復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院PI 溫文玉教授對張明杰教授的工作進(jìn)行了系統(tǒng)解讀，見延伸閱讀） 另外，體外相分離的體外實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性。體外相分離實(shí)驗(yàn)最大的優(yōu)勢是在于其各個組分以及各個組分的濃度，以及各種外在條件（比如：溫度，pH等條件）可以被嚴(yán)格控制，更加方便我們?nèi)パ芯肯喾蛛x現(xiàn)象。因此，需要注意的是，相關(guān)的蛋白以及RNA、DNA等各個組分的純度是至關(guān)重要的。在此，作者提出了用于體外相分離實(shí)驗(yàn)的蛋白以及核酸樣品的表達(dá)純化，保存以及樣品處理的標(biāo)準(zhǔn)。 蛋白純化的考慮 用于體外相分離實(shí)驗(yàn)的蛋白可以在E.coli，酵母或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)純化，或者通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)得到。在能夠發(fā)生相分離的蛋白中普遍存在無序區(qū)域（IDR：Intrici Disordered Region）在純化的過程中非常容易被降解，因此在純化此類蛋白時需要特別加以注意。含有IDR的蛋白質(zhì)通常需要在純化體系中加入蛋白酶抑制劑，需要快速純化以防止蛋白的降解和蛋白聚集。另外，純化此類蛋白可以讓目的蛋白大量表達(dá)進(jìn)細(xì)菌包涵體里面，這種方式可以防止被宿主體內(nèi)的蛋白酶降解。但是，需要注意的是，在進(jìn)行相分離實(shí)驗(yàn)之前，必須將蛋白復(fù)性到生理?xiàng)l件的緩沖液中。另外，表達(dá)蛋白的時候帶上一些助溶的標(biāo)簽，比如MBP等，可以幫助得到較好的蛋白，但是在進(jìn)行相分離實(shí)驗(yàn)的之前，需要將這些標(biāo)簽切掉，以免這些標(biāo)簽帶來一些影響。 另外需要注意的是，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTM）對于相分離是非常重要的，在細(xì)菌表達(dá)純化出來的蛋白一般翻譯后修飾非常少，在真核細(xì)胞純化的蛋白一般具有較好的翻譯后修飾，建議真核表達(dá)的蛋白在做實(shí)驗(yàn)之前，最好先使用質(zhì)譜等方式鑒定其翻譯后修飾，以保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性以及利于更深入地了解該蛋白發(fā)生相分離的具體的分子機(jī)制。 在純化的過程中，一般要避免目的蛋白發(fā)生相分離現(xiàn)象，但是如果發(fā)生相分離后，可以被一定的條件重新溶解，也可以通過利用這種反復(fù)發(fā)生相分離，溶解的方法來純化該蛋白。純化出來的蛋白需要用SDS-PAGE以及質(zhì)譜等方式鑒定是否確實(shí)是目的蛋白以及鑒定其純度。我們建議將蛋白保存在不發(fā)生相分離的Buffer中，保存Buffer通常在中性的pH, 使用高濃度或者非常低濃度的鹽離子來防止發(fā)生相分離現(xiàn)象。同時需要加入還原劑。常用的Buffer體系如下（pH 緩沖體系：50mM HEPES pH7.5, 鹽離子：300 mM NaCl或者500 mM KCl, 或者不加鹽離子，還原劑：1mM TCEP 或者5mM DTT ）。我們建議將蛋白分裝后使用液氮速凍以后保存在低溫的條件下，不要凍融蛋白，凍融會導(dǎo)致蛋白的聚集以及部分變性，影響其性質(zhì)。在做相分離實(shí)驗(yàn)的時候，需要注意，對于每一個蛋白而言，都需要優(yōu)化相應(yīng)的PH，鹽離子濃度以及溫度等條件，盡量使其接近生理?xiàng)l件。詳細(xì)的一些tips, 建議讀者閱讀另外一篇文章（Alberti et al., 2018）A User’s Guide for Phase Separation Assays with Purified Proteins RNA來源 許多相分離需要使用RNA。 RNA可以使用體外轉(zhuǎn)錄或者直接化學(xué)合成。體外轉(zhuǎn)錄是較長的RNA非常好的來源，短鏈RNA可以直接從一些公司購買。 可以將RNA使用熒光標(biāo)記，從而更方便的檢測RNA與蛋白相分離的現(xiàn)象。 Macromolecular Crowders 另外，相分離對物理化學(xué)條件的變化非常敏感。溫度，蛋白，核酸或鹽濃度的微小差異也會導(dǎo)致不同的結(jié)果。因此，體外相分離實(shí)驗(yàn)應(yīng)精確控制緩沖液的體系和蛋白濃度。 在相分離的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常使用到一些Macromolecular crowders，比如：PEG，Dextran或Ficoll。很多情況下，添加到實(shí)驗(yàn)中的crowder的量可能超過存在于細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境。目前，crowder是如何促進(jìn)相分離發(fā)生的具體的機(jī)制仍不明確，因此，應(yīng)當(dāng)慎重使用crowder。如果使用crowder，我們建議使用多種crowder做實(shí)驗(yàn)，以排除由于Crower帶來的假陽性的結(jié)果（私底下聽到過有老師提到，可能80%左右的蛋白在有Crower存在的時候都可以發(fā)生相分離）。 小分子對于相分離的影響 在體外相分離實(shí)驗(yàn)體系中，可以測定LLPS是否改變酶的活性，從而研究相分離的生物學(xué)意義。在一些體外實(shí)驗(yàn)中，通常需要將高濃度的小分子化學(xué)物質(zhì)（例如激酶抑制劑，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑等）添加到相分離體系中。此時應(yīng)該考慮到，這些高劑量的小分子化學(xué)物質(zhì)，除了本身對酶活的影響外，還可能對相分離產(chǎn)生直接作用，從而影響了酶活。 在體外，IDR通常足以介導(dǎo)相分離的發(fā)生。在高濃度下相分離的IDR的例子：Ddx4，LAF-1，F(xiàn)US，hnRNPA1和Whi3的IDR。這些結(jié)果提示了這些IDR能夠自主地通過homotypic interactions驅(qū)動相分離的發(fā)生。越來越多的證據(jù)顯示，與同一多肽或其他蛋白其他區(qū)域的heterotypic interactions也可以驅(qū)動相分離的發(fā)生。另外，簡單的單組分或雙組分系統(tǒng)建立的理論如何擴(kuò)展到細(xì)胞中的更復(fù)雜的混合物中，是亟待解決的問題。 相分離的物理特性 相分離液滴的物理狀態(tài)變化極大。從液滴樣直至多孔固體或膠體，其特性取決于相分離中的分子構(gòu)成、時間、液滴的穩(wěn)定程度、淬滅深度等。RNA的參與也可以影響相分離液滴的物理狀態(tài)，但由于RNA既提供了多價結(jié)合位點(diǎn)、又貢獻(xiàn)了靜電，尚不清楚RNA究竟使其更流體化還是更固態(tài)化。由于不可逆的固態(tài)常被認(rèn)為是一種病理狀態(tài)，因此調(diào)控相分離的物理狀態(tài)的因素仍有待進(jìn)一步探究。體外重現(xiàn)相分離時，有多種方法可對液滴的物理性質(zhì)進(jìn)行具體描述。最直接的方法即測量表征表面張力的反毛細(xì)管速度，輔以被動微流變學(xué)，可推測液滴的表面張力。液滴表面與蓋玻片間的接觸角亦可表征液滴表面張力及表面的化學(xué)性質(zhì)。 被動微觀流變學(xué)通過在液滴內(nèi)部置以珠子、測量該珠子的均方位移的方法表征液滴的物理性質(zhì)。該方法受到多種因素的影響如液滴的組成、珠子的材料及大小、珠子表面的鈍化程度、顯微鏡設(shè)備的漂移等。當(dāng)相分離液滴極其粘稠乃至類似于膠體時，則可使用原子力顯微鏡或光鑷來測量液滴內(nèi)部的硬度。此外，還可使用熒光標(biāo)記的右旋糖苷來檢測相分離液滴中聚合物網(wǎng)格的孔徑大小，以描述液滴的物理狀態(tài)。 熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)（FRAP）常用于測量液滴的流動性，且其恢復(fù)時間因蛋白/RNA的不同而表現(xiàn)出很大的差異，尤其當(dāng)對比蛋白質(zhì)與RNA形成的相分離時，由于RNA的結(jié)構(gòu)相對較剛性，其相分離液滴的FRAP時間往往更長。盡管FRAP是一個非常常見的實(shí)驗(yàn)，其應(yīng)用的限制性卻常常被忽略了。如FRAP的恢復(fù)時間不僅僅取決于液滴的稀釋度，還取決于被光漂白的液滴大小、內(nèi)部流動性、光漂白區(qū)域的大小等。如果條件允許，半熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)可以提供更多的關(guān)于液滴內(nèi)部流動性的信息。此外，F(xiàn)RAP還可以用于評估液滴內(nèi)部的同質(zhì)性，但不能作為確定某一結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制是相分離的依據(jù)。 為更準(zhǔn)確的估計(jì)相分離液滴內(nèi)部某一分子的擴(kuò)散能力，熒光相關(guān)光譜可作為檢測手段之一。此外，偏振熒光顯微鏡可檢測相分離液滴內(nèi)部纖維性或固態(tài)樣結(jié)構(gòu)的各向異性成分。 檢測細(xì)胞內(nèi)的相分離現(xiàn)象 目前相分離領(lǐng)域的一個難點(diǎn)就是如何去鑒別細(xì)胞內(nèi)的一些特殊的結(jié)構(gòu)是否真的是相分離形成。在體外特定條件下，一些蛋白和RNA在足夠的濃度或者合適的Buffer的情況下會發(fā)生相分離現(xiàn)象，通常通過在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)這些蛋白，觀察到形成較大的，球狀的結(jié)構(gòu)，以此來推測細(xì)胞內(nèi)低濃度的該蛋白仍然會形成相分離，只是在普通的光學(xué)顯微鏡下無法檢測到而已。然而，相分離需要足夠濃度才能發(fā)生，因此，在使用過表達(dá)蛋白檢測相分離的時候一定要考慮到外源過表達(dá)帶來的影響。同時應(yīng)該致力于尋找除過度表達(dá)之外的其他方式去證明細(xì)胞內(nèi)確實(shí)發(fā)生了相分離現(xiàn)象。 目前被大家所接受的認(rèn)為是相分離結(jié)構(gòu)的的標(biāo)準(zhǔn)：形成球狀結(jié)構(gòu)，能夠融合，同時使用FRAP技術(shù)，證明其能夠發(fā)生熒光漂白恢復(fù)（圖4）。但是FRAP實(shí)驗(yàn)并不是證明LLPS發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)，仍然存在很多問題。 圖4：檢測相分離的方法 體內(nèi)相分離液滴的物理特性 體外重現(xiàn)相分離現(xiàn)象時，對液滴物理特性的研究手段不勝枚舉：如可利用延時顯微鏡測量液滴的反毛細(xì)管速度、通過FRAP測量液滴的流動性。然而如何探究體內(nèi)相分離液滴的物理性質(zhì)仍是一個難題。目前已有的手段如基因編碼的納米粒（GEMS）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）、定量相顯微鏡（QPM）、折射率層析成像技術(shù)及更先進(jìn)的布里淵顯微鏡等都可對體內(nèi)相分離液滴的物理特性進(jìn)行初步描繪。此外，體內(nèi)相分離液滴的生物學(xué)功能也是研究的重點(diǎn)之一，如何改變液滴的性質(zhì)以觀察其功能，是未來的研究重點(diǎn)。 應(yīng)用高分子化學(xué)來指導(dǎo)相分離研究的可行性及局限性 液液相分離研究的目標(biāo)之一，是建立能夠解釋和預(yù)測大分子相分離現(xiàn)象的理論體系，并通過一級序列預(yù)測相分離的飽和濃度、刺激因素、液滴狀態(tài)。高分子化學(xué)中的弗洛里赫金斯理論描述的是由焓介導(dǎo)的均聚合物從貧溶劑中析出的化學(xué)基礎(chǔ)，其擴(kuò)展理論考慮到了這一過程中的靜電力作用。無規(guī)相近似方法則僅僅考慮了帶電氨基酸的序列特征對雜聚體的形成的影響。此外，通過近似模擬也可以對相分離現(xiàn)象的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)掘：對單分子蛋白的模擬已能夠較準(zhǔn)確的說明其序列和功能間的關(guān)系，然而對成百上千個分子構(gòu)成的相分離現(xiàn)象的建模及分析仍是目前的難點(diǎn)之一。對多組分相分離系統(tǒng)的粗?；M初步解釋了多層無膜細(xì)胞器如核仁形成的物理機(jī)制：蛋白-蛋白間、蛋白-RNA間的相互作用由序列決定；而不同細(xì)胞組分之間的相互作用呈互斥或親和的狀態(tài)，則可最終導(dǎo)致非隨機(jī)的多層結(jié)構(gòu)的形成。 算法模擬及理論體系可作為相分離現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有力補(bǔ)充。反之，體內(nèi)相分離現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)描述可作為算法模擬的數(shù)據(jù)庫、并從中產(chǎn)生能夠描述多分子復(fù)雜相分離現(xiàn)象的新的理論。 相分離到底意味著什么？研究相分離生物學(xué)功能 相分離研究的重點(diǎn)還是在于對其生物學(xué)功能的闡述。作者對目前報(bào)道的生物學(xué)功能進(jìn)行了歸納總結(jié)（圖5）： 圖5：相分離功能總結(jié) 1. LLPS可以感知環(huán)境的變化，并對環(huán)境的變化做出快速響應(yīng)。這種響應(yīng)比通過細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄以及翻譯過程更加快速。目前的一些研究已經(jīng)證明，LLPS可以感知溫度以及pH, 另外，還可以用于感知細(xì)胞內(nèi)外源的DNA（cGAS相分離） 2. LLPS可以用來調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的濃度。LLPS可以將高濃度的蛋白以液滴的形式儲存起來，在細(xì)胞需要的時候?qū)⒃摰鞍揍尫诺郊?xì)胞環(huán)境中。 3. LLPS可以形成局部的高濃度蛋白，從而激活一些生化反應(yīng)，激活相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及促進(jìn)細(xì)胞骨架的形成。 4. LLPS可以將一些蛋白與其底物隔離，從而抑制細(xì)胞內(nèi)的一些生化反應(yīng)過程。 5. LLPS可以介導(dǎo)一些蛋白定位到已經(jīng)存在的一些無膜包裹的細(xì)胞器中。 6. LLPS的特殊結(jié)構(gòu)可能對于細(xì)胞的形態(tài)起著重要作用。 7. LLPS可以介導(dǎo)形成一些孔狀結(jié)構(gòu)，比如核孔。 近年來，相分離領(lǐng)域已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的大熱點(diǎn)，更多的相關(guān)的文章還在持續(xù)不斷的發(fā)表，該領(lǐng)域?qū)τ诮沂疽恍┘?xì)胞的基礎(chǔ)生物學(xué)問題以及對一些疾病的發(fā)生發(fā)展都將提供全新的思路。就在解讀這篇文章的過程中，注意到Michael Rosen組在生物學(xué)預(yù)印本bioRxiv上online了一篇題為Organization and Regulation of Chromatin by Liquid-Liquid Phase Separation文章，說明了相分離在染色體的結(jié)構(gòu)上起著重要的作用。 另外，去年12月份在深圳舉行的的華人生物學(xué)家雙年會上(The 12th biennial meeting of Chinese Biological Investigators Society )，諾獎得主Yoshinori Ohsumi 介紹了其實(shí)驗(yàn)室最新的研究進(jìn)展， ATG13與ATG17結(jié)合能夠發(fā)生phase separation的現(xiàn)象，揭示了autophagy中幾個關(guān)鍵的conjugation system形成的物理學(xué)基礎(chǔ)，作者發(fā)現(xiàn)突變了關(guān)鍵位點(diǎn)的 ATG13 與 ATG17 不再能形成相分離結(jié)構(gòu)。從體外純化的蛋白以及在細(xì)胞內(nèi)都驗(yàn)證了這一理論。另外，去年清華大學(xué)俞立教授與李丕龍教授今年在 Cell research 上發(fā)表 了 Polyubiquitin chain-induced p62 phase separation drives autophagic cargo segregation的文章，報(bào)道了autophagy的adaptor protein P62能夠發(fā)生相分離現(xiàn)象， 而且此現(xiàn)象能夠介導(dǎo) autophagy 對于底物的選擇性。這些研究都將進(jìn)一步拓展我們對于autophagy等領(lǐng)域的認(rèn)識； 原文鏈接： https://www./science/article/pii/S0092867418316490 延伸閱讀： 1. 李丕龍?zhí)卦u丨生物大分子的“相變”——簡談近期系列“相變”研究成果； 2. Science亮點(diǎn)丨超級增強(qiáng)子通過相分離調(diào)控基因表達(dá)； 3. Nature丨廈大/UCB周強(qiáng)組揭示相分離對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制； 4. Cell亮點(diǎn)丨mTORC1通過調(diào)節(jié)擁擠來控制相分離和細(xì)胞質(zhì)的生物物理性質(zhì)； 5. Cell丨張明杰組破解突觸的建立與可塑性調(diào)節(jié)的機(jī)制——溫文玉解讀； 6. 復(fù)旦溫文玉組揭示蛋白相變調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)決定因子定位的分子機(jī)制； 7. Cell丨張宏組揭示mTOR調(diào)控相變以及自噬性降解的機(jī)制——李丕龍解讀 8. Nature：RNA相變導(dǎo)致神經(jīng)疾病的機(jī)制丨BioArt國科大論壇 9. 特別推薦丨飽和脂肪酸“凍”住了細(xì)胞膜——新成像技術(shù)揭示細(xì)胞脂毒性新機(jī)理 11. Cell Research丨“異”曲同工之妙—李海濤/孫前文/李丕龍合作組首次完整發(fā)現(xiàn)植物中特有的異染質(zhì)蛋白 12. Cell亮點(diǎn)丨馬為銳博士等發(fā)現(xiàn)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交織的無膜細(xì)胞器促進(jìn)3?UTR介導(dǎo)的蛋白-蛋白相互作用 13. 專家解讀Cell丨基因表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)入新階段“Phase” 14. Cell亮點(diǎn) ︱ 核內(nèi)“液-液相分離”對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的感知與重塑 15. Mol Cell丨張明杰組報(bào)道相分離對于重新認(rèn)識突觸的形成與維持的重要意義 參考文獻(xiàn) 1. C. P. Brangwynne et al., Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science 324, 1729-1732 (2009). 2. S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. 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