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社會(huì)等級(jí)（social hierarchy）是指動(dòng)物種群中各個(gè)動(dòng)物的地位具有一定順序的等級(jí)現(xiàn)象。等級(jí)形成的基礎(chǔ)是支配行為，或稱支配-從屬（dominant-submissive）關(guān)系。 
圖片來(lái)源：Debt Reduction Services 社會(huì)等級(jí)是一種自然發(fā)生的現(xiàn)象，在人類及多種動(dòng)物中具有進(jìn)化保守性[1, 2]。神經(jīng)生物學(xué)研究表明，社會(huì)等級(jí)的建立依賴于多個(gè)腦區(qū)，如內(nèi)側(cè)前額葉皮層（mPFC）、海馬、杏仁核、伏隔核等等，其中mPFC尤為重要[1, 3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)小鼠mPFC的神經(jīng)元活性升高，而抑制mPFC神經(jīng)元活性則會(huì)導(dǎo)致小鼠社會(huì)等級(jí)下降[4, 5]。然而，有關(guān)mPFC神經(jīng)元調(diào)控社會(huì)等級(jí)的分子機(jī)制，尚未可知。圖片來(lái)源：onlinemarketinginct.com另有研究顯示，自閉癥等多種異常社交行為與長(zhǎng)非編碼RNA (lncRNA)密切相關(guān)[6, 7]。那么，lncRNA，尤其是mPFC神經(jīng)元中的lncRNA，是否參與社會(huì)等級(jí)的調(diào)控呢？圖片來(lái)源：J Cell Mol Med. [8]2020.01.20日，《Cell Research》雜志在線刊登了華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院朱鈴強(qiáng)、劉丹課題組的最新重要工作[9]，他們?cè)趍PFC中發(fā)現(xiàn)一種lncRNA——AtLAS，這種lncRNA可調(diào)節(jié)突觸蛋白IIb的表達(dá)水平從而調(diào)控AMPA受體的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，進(jìn)而影響小鼠的社會(huì)等級(jí)。該研究首次發(fā)現(xiàn)AtLAS及突觸蛋白IIb對(duì)社會(huì)等級(jí)的調(diào)控作用，極大提高了人們?cè)谏缃恍袨轭I(lǐng)域的認(rèn)知。
朱鈴強(qiáng)教授 
1.社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)鼠mPFC的lncRNA表達(dá)譜 首先，作者通過(guò)鉆管實(shí)驗(yàn)（tube test）篩選出社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)鼠與劣勢(shì)鼠，再通過(guò)微陣列分析手段探究?jī)?yōu)勢(shì)鼠和劣勢(shì)鼠mPFC的lncRNA表達(dá)譜差異（圖1a）。他們發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)鼠mPFC中，181種lncRNA表達(dá)上調(diào)，97種lncRNA表達(dá)下調(diào)，其中AK013786表達(dá)下調(diào)水平最高（圖1b-c）。基因組定位結(jié)果顯示，AK013786是突觸蛋白II的反義lncRNA，作者將其命名為AtLAS。AtLAS的3’端包含一段poly-A序列，其序列與UCSC基因組數(shù)據(jù)庫(kù)序列相一致，主要表達(dá)在興奮性神經(jīng)元中（圖1d-f）。此外，AtLAS表達(dá)水平僅在優(yōu)勢(shì)鼠的mPFC中顯著下調(diào)，在嗅球、紋狀體、海馬等其它腦區(qū)表達(dá)水平幾乎不變（圖1g）。
圖1 社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)鼠mPFC的lncRNA表達(dá)譜
2.mPFC錐體神經(jīng)元中AtLAS雙向調(diào)控社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì) 接下來(lái)，為探究AtLAS是否參與社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)的形成，作者使用shRNA介導(dǎo)的基因沉默方法。他們?cè)贑amKII-Cre小鼠的mPFC中注射AAV-DIO-sh-AtLAS以下調(diào)mPFC錐體神經(jīng)元中AtLAS的表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)這些小鼠的社會(huì)等級(jí)顯著上升（圖2a-d）。除此之外，他們?cè)趦?yōu)勢(shì)小鼠的mPFC中注射AAV-CamKII-AtLAS以在錐體神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)AtLAS的過(guò)表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)這些小鼠的社會(huì)等級(jí)顯著下降（圖2e-g）。以上結(jié)果表明，mPFC錐體神經(jīng)元AtLAS在社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)的形成過(guò)程中具有充分必要性。
圖2 mPFC錐體神經(jīng)元中AtLAS雙向調(diào)控社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)
3. AtLAS調(diào)控突觸蛋白II不同亞型的表達(dá)水平 在知悉AtLAS的功能后，作者就其靶向分子展開進(jìn)一步探究。AtLAS位于6號(hào)染色體的負(fù)鏈，在突觸蛋白II的互補(bǔ)鏈上（圖3a），因此它有可能通過(guò)順式作用調(diào)控突觸蛋白II不同亞型的表達(dá)水平[10]。事實(shí)上，注射AAV-DIO-sh-AtLAS的CamKII-Cre小鼠mPFC神經(jīng)元中，突觸蛋白IIb（Syn2b）的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而突觸蛋白IIa（Syn2a）的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖3b-c）。另外，作者發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)鼠AtLAS的缺失主要發(fā)生于細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)中（圖3d），于是他們推測(cè)AtLAS可能通過(guò)調(diào)節(jié)突觸蛋白II基因的可變多聚腺苷酸化（APA），進(jìn)而調(diào)控突觸蛋白IIa/b的比率。他們還發(fā)現(xiàn)，Syn2b基因的3’-UTR區(qū)域有兩個(gè)CUGBP, ELAV-like family member 4（CELF4）蛋白結(jié)合域（圖3e-f）。事實(shí)上，CELF4也可以和突觸蛋白II基因外顯子11和外顯子12之間的序列（pre-Syn2）相結(jié)合（圖3g-h）。而在AtLAS過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，CELF4與pre-syn2結(jié)合親和性顯著下降（圖3i）。此外，作者發(fā)現(xiàn)CELF4只能結(jié)合單鏈Syn2b 3’-UTR，而不能結(jié)合AtLAS與Syn2b 3’-UTR形成的雙鏈結(jié)構(gòu)（圖3j）。他們構(gòu)建了pre-Syn2刪除了CELF4結(jié)合位點(diǎn)的突變體，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CELF4不再影響突觸蛋白IIa/b的比率（圖3k-l）。他們還合成了反義鏈以進(jìn)一步確認(rèn)了CELF4與pre-Syn2的結(jié)合位點(diǎn)（圖3m）。 綜上所述，CELF4與Syn2b 3’-UTR結(jié)合，并且阻礙了Syn2b的APA，此作用反過(guò)來(lái)促進(jìn)了Syn2a的表達(dá)。AtLAS阻斷了CELF4與Syn2b 3’-UTR的結(jié)合作用，進(jìn)而改變了Syn2a/b的表達(dá)比率。圖3 AtLAS調(diào)控突觸蛋白IIa/b的表達(dá)水平
4.Syn2b而非Syn2a參與社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)的形成 然后，作者探究Syn2a和Syn2b是否參與社會(huì)等級(jí)的形成過(guò)程。通過(guò)WB和qPCR方法，作者發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)鼠的mPFC中Syn2a表達(dá)水平顯著上調(diào)，Syn2b表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖4a-b）。然后，他們?cè)趦?yōu)勢(shì)鼠的mPFC中注射AAV-CaMKII-Syn2b以在錐體神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)Syn2b的過(guò)表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)這些小鼠的社會(huì)等級(jí)顯著下降（圖4c-e）。而在優(yōu)勢(shì)鼠mPFC的錐體神經(jīng)元中下調(diào)Syn2a表達(dá)水平，則無(wú)此現(xiàn)象。他們還引入了Syn-2b基因敲低小鼠模型，得到了相似結(jié)果（圖4f-i）。以上結(jié)果表明，Syn-2b表達(dá)水平下調(diào)介導(dǎo)了社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)的形成。
圖4 Syn2b而非Syn2a參與社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)的形成
5.AtLAS/Syn2b的缺失強(qiáng)化AMPA受體介導(dǎo)的興奮性輸入 研究表明，在優(yōu)勢(shì)鼠mPFC第5層錐體神經(jīng)元中記錄到的微小興奮性突觸后電流幅度（mEPSC）更大[4]。于是，作者就AtLAS/Syn2b對(duì)mPFC錐體神經(jīng)元電生理性質(zhì)的影響展開進(jìn)一步探究。他們?cè)贑amKII-Cre小鼠的mPFC中注射AAV-DIO-sh-AtLAS，使用膜片鉗電生理方法記錄mPFC錐體神經(jīng)元（圖5a）。他們發(fā)現(xiàn)，在這些小鼠錐體神經(jīng)元中記錄到的mEPSC幅度顯著增大，AMPA受體與NMDA受體介導(dǎo)電流的比值（A/N ratio）也顯著增加，而脈沖配對(duì)比值（PPR）不變（圖5b-e）。而過(guò)表達(dá)AtLAS/Syn2b后，在優(yōu)勢(shì)鼠錐體神經(jīng)元中記錄到的mEPSC幅度顯著減?。▓D5f-k）。此外，他們還在海馬中沉默AtLAS，發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元中記錄到的mEPSC幅度亦顯著增加。PPR常用于表征突觸前遞質(zhì)釋放水平，因此mEPSC幅度的增加很可能為突觸后作用，即由更多的AMPA受體引起。結(jié)合以上結(jié)果，AtLAS/Syn2b的缺失很可能增加AMPA受體的膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率，進(jìn)而強(qiáng)化神經(jīng)元的興奮性輸入。
圖5 AtLAS/Syn2b的缺失強(qiáng)化AMPA受體介導(dǎo)的興奮性輸入
6.Syn2b作用于突觸后AMPA受體進(jìn)而調(diào)控小鼠社會(huì)等級(jí) 再然后，作者探究Syn2b是否作用于突觸后的AMPA受體。通過(guò)突觸各部分的分離，作者發(fā)現(xiàn)Syn2a、Syn2b在突觸前、后均有表達(dá)（圖6a-c），而只有Syn2b與AMPA受體的GluA1、GluA2亞基結(jié)合（圖6d-f）。沉默正常小鼠mPFC神經(jīng)元中AtLAS后，及優(yōu)勢(shì)鼠mPFC神經(jīng)元中，細(xì)胞膜內(nèi)GluA1、GluA2亞基的含量顯著升高。（圖6g-h）。作者還在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染突觸蛋白II各亞型以及GluA1、GluA2亞基，發(fā)現(xiàn)只有Syn2b可以和GluA1、GluA2亞基結(jié)合，與上文假設(shè)相一致（圖6i-j）。
圖6 Syn2b而非Syn2a作用于突觸后AMPA受體 最后，為探究 Syn2b作用于AMPA受體各亞基的功能，作者設(shè)計(jì)一種膜穿透性肽——P-2B，這種肽可以干擾Syn2b和AMPA受體的結(jié)合（圖7a-c）。他們發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的PFC神經(jīng)元中孵育P-2B后，膜AMPA受體含量顯著增加，且記錄到的mEPSC幅度顯著增大（圖7d-h）。他們還發(fā)現(xiàn)，連續(xù)10天通過(guò)腹腔注射方式給予小鼠P-2B后，小鼠的社會(huì)等級(jí)顯著增加（圖7i），表明Syn2b和AMPA受體作用的缺失增加了AMPA受體的突觸后膜轉(zhuǎn)運(yùn)率，進(jìn)而建立起社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)。
圖7 Syn2b作用于AMPA受體進(jìn)而改變其膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率與機(jī)體的社會(huì)等級(jí) 社會(huì)等級(jí)是一種存在于人類及多種動(dòng)物中的保守性現(xiàn)象，是食物、棲息地等資源獲取順序的指導(dǎo)原則。研究表明，大腦mPFC在社會(huì)等級(jí)的形成過(guò)程中扮演重要角色，但究其分子機(jī)制，我們知之甚少。本篇文章結(jié)合lncRNA微陣列分析、基因沉默、基因過(guò)表達(dá)、行為學(xué)等方法，發(fā)現(xiàn)mPFC神經(jīng)元中AtLAS可調(diào)節(jié)突觸蛋白II的APA，以增加Syn2b的表達(dá)水平。Syn2b可作用于突觸后AMPA受體以減少其膜轉(zhuǎn)運(yùn)率，進(jìn)而影響mPFC錐體神經(jīng)元的興奮性傳遞，最終改變小鼠的社會(huì)等級(jí)（圖8）。這項(xiàng)研究通過(guò)基因沉默與基因過(guò)表達(dá)等多種策略，在社交行為領(lǐng)域取得了新的進(jìn)展，讓我們更加了解社會(huì)等級(jí)背后的大腦！
圖8 社會(huì)等級(jí)優(yōu)勢(shì)鼠和劣勢(shì)鼠mPFC神經(jīng)元中的分子通路 和元上海有幸提供實(shí)驗(yàn)中使用的大量AAV工具病毒載體，用實(shí)際行動(dòng)助力中國(guó)腦科學(xué)的發(fā)展。 朱鈴強(qiáng)，三級(jí)教授，博士生導(dǎo)師，中組部萬(wàn)人計(jì)劃青年拔尖人才，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃獲得者、耶魯大學(xué)博士后、華中學(xué)者特聘崗、國(guó)際雜志Journal of Alzheimer’s Disease（影響因子3.9）Senior Editor、全國(guó)百篇優(yōu)秀博士論文提名獎(jiǎng)獲得者，湖北省杰出青年基金獲得者，2016湖北省科協(xié)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才工程，華中科技大學(xué)首屆學(xué)術(shù)前沿青年團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人，首屆學(xué)術(shù)新人獎(jiǎng)獲得者。目前以通訊作者和第一作者發(fā)表Nature Neuroscience、Neuron等SCI論文70篇。 劉丹，副教授，碩士生導(dǎo)師，湖北省優(yōu)秀博士論文獲得者。研究方向：表觀遺傳學(xué)在神經(jīng)精神疾病中的作用。承擔(dān)國(guó)家自然科學(xué)基金三項(xiàng)。目前發(fā)表Neuron、BPS等SCI論文24篇。 和元上海一直致力為神經(jīng)科學(xué)研究提供整體研究方案，從標(biāo)記、示蹤、基因操作、生理操作到觀察，提供病毒包裝、動(dòng)物模型構(gòu)建、病理研究等一站式服務(wù)。用實(shí)際行動(dòng)助力中國(guó)腦科學(xué)的發(fā)展！ 1.Zink, C.F., et al., Know your place: neural processing of social hierarchy in humans. Neuron, 2008. 58(2): p. 273-83. 2.Nagy, M., et al., Hierarchical group dynamics in pigeon flocks. Nature, 2010. 464(7290): p. 890-3. 3.Singer, T., The past, present and future of social neuroscience: a European perspective. Neuroimage, 2012. 61(2): p. 437-49. 4.Wang, F., et al., Bidirectional control of social hierarchy by synaptic efficacy in medial prefrontal cortex. Science, 2011. 334(6056): p. 693-7. 5.Holson, R.R., Mesial prefrontal cortical lesions and timidity in rats. III. Behavior in a semi-natural environment. Physiol Behav, 1986. 37(2): p. 239-47. 6.Wilkinson, B. and D.B. Campbell, Contribution of long noncoding RNAs to autism spectrum disorder risk. Int Rev Neurobiol, 2013. 113: p. 35-59. 7.Briz, V., et al., The non-coding RNA BC1 regulates experience-dependent structural plasticity and learning. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 293. 8.Salehi, S., et al., State of The Art Technologies Used to Explore Long Non-coding RNAs in Cancer Disease. Cellular and Molecular of Medicine, 2017. 21. 9.Ma, M., et al., A novel pathway regulates social hierarchy via lncRNA AtLAS and postsynaptic synapsin IIb. Cell Research, 2020. 10.Mattick, J.S. and M.J. Gagen, The evolution of controlled multitasked gene networks: the role of introns and other noncoding RNAs in the development of complex organisms. Mol Biol Evol, 2001. 18(9): p. 1611-30.
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