一、概述

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，這一變化早于細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA片斷化和細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。

AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。

因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

圖Annexin V 檢測(cè)細(xì)胞凋亡原理

二、試劑盒組份

三、實(shí)驗(yàn)步驟

貼壁細(xì)胞需用0.25%的胰酶消化。注意過度消化可損傷細(xì)胞。在消化時(shí)可加2％的BSA可防止消化過度。如果用含EDTA的胰酶消化時(shí)，注意必須徹底清除EDTA：在標(biāo)記前用1×PBS或1×bindingbuffer洗滌，清除EDTA，以免殘余的EDTA與Ca2＋螯合，影響Annexin V的結(jié)合。

（1）用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer；

（2）細(xì)胞收集。懸浮細(xì)胞收集：離心5分鐘；貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化時(shí)間不宜過長，否則會(huì)影響細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合），于室溫2000rpm離心5～10分鐘，收集細(xì)胞；

（3）細(xì)胞洗滌：用預(yù)冷1×PBS（4℃）重懸細(xì)胞一次，2000rpm離心5～10分鐘，洗滌細(xì)胞；

（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；

（5）Annexin V-FITC標(biāo)記：加入5μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15分鐘；

（6）PI標(biāo)記：上機(jī)前5分鐘再加入5μL的PI染色。

（7）上機(jī)前，補(bǔ)加200μL的1×Binding Buffer。

四、保存：

4℃保存；避免反復(fù)凍融。

五、注意事項(xiàng)

（1）本試劑只適用于實(shí)驗(yàn)，不適用于臨床檢測(cè)；

（2）PI（propidium iodide，碘化丙錠）有毒性，能通過皮膚吸收，對(duì)眼睛有刺激作用，使用時(shí)需戴手套；

（3）Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。在處理和標(biāo)記時(shí)，盡可能在暗處進(jìn)行。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細(xì)胞標(biāo)記后，在暗室內(nèi)用顯微鏡觀察；

（4）整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4℃下操作，以免影響細(xì)胞狀態(tài)。

（5）在細(xì)胞洗滌的最后一步，請(qǐng)盡量將上清棄凈，以免PBS殘留，有可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（6）為防止熒光衰變，宜在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè)。

（7）PI染色時(shí)間過長有可能造成檢測(cè)的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC染色，最短可在上機(jī)前5分鐘再加入PI染色。、

其他Annexin V系列產(chǎn)品清單：