關(guān)于細胞凋亡，你不知道的那些事

tysdne 2019-06-27

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月黑風(fēng)高夜，四下無人時，實驗大樓在月光的映照下顯得格外素凈。

突然，只聽樓里傳來一陣哀嚎：「我掏心掏肺地對你們好，你們卻如此狠心，離我而去?！箤ぢ曂ィ灰娨晃话滓履凶?，蹲坐在地，抱著培養(yǎng)基哭泣。

額，原來是細胞又養(yǎng)死了。。。

面對日日夜夜精心培養(yǎng)的細胞撒手而去，有如此反應(yīng)也不為過。如何讓這群金貴的小家伙「長命百歲」，是讓科研人深思的問題。

正所謂：知其死，方能知其何以生。那么接下來就讓我們追根溯源，聊一聊細胞凋亡的那些事。（文末彩蛋，可免費申請凋亡檢測試劑盒）

引言

細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在一定時間內(nèi)，細胞按一定的程序發(fā)生死亡，這種細胞死亡具有嚴格的基因時空性和選擇性。

與細胞壞死不同，它不是病理條件下的自體損傷，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境主動爭取的一種死亡過程。凋亡缺陷會導(dǎo)致腫瘤等細胞死亡障礙疾病的發(fā)生，在某些情況下如心臟受襲也會導(dǎo)致凋亡過激從而殺死許多無辜細胞。

細胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等，其特征在于質(zhì)膜不對稱性和附著的喪失，核質(zhì)濃縮，核膜、核仁碎裂，DNA 片段化和 mRNA 衰變等，早期特征之一是質(zhì)膜的改變。

細胞凋亡普遍存在于人類及多種動、植物中，是多細胞生物個體正常發(fā)育、維持成體組織結(jié)構(gòu)不可缺少的部分，貫穿于生物全部的生命活動中。

細胞凋亡的分子機制

凋亡可被多種細胞信號激活，如鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化損傷、線粒體損傷、毒素、生長因素和激素刺激等。細胞凋亡過程大致分為：凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)→凋亡基因激活→細胞凋亡的執(zhí)行→凋亡細胞的清除。經(jīng)典的細胞凋亡機制可分為內(nèi)源性信號通路和外源性信號通路兩種。

內(nèi)源性凋亡信號通常激活線粒體途徑。凋亡蛋白 Bid 誘導(dǎo)凋亡蛋白 Bcl-2 拮抗劑 Bak 和 Bcl-2 結(jié)合蛋白 Bax 的激活，它們形成的聚合體插入線粒體外膜引起膜電位下降和細胞凋亡關(guān)鍵蛋白的釋放，如細胞色素 C、SMAC / DIABLO 及凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等，激活 Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細胞凋亡。

外源性死亡受體途徑開始于特異性死亡受體與配體結(jié)合，如 FasL（CD95）或 TNFR1 分別和配體 Fas 或 TNF-α 結(jié)合，使死亡受體的結(jié)構(gòu)域寡聚化，后募集 Caspase-8 和銜接蛋白 FADD 形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體 DISC。激活的 Caspase-8 引發(fā)后續(xù) Caspase 級聯(lián)反應(yīng)促進細胞死亡，它還能與 Bid 相互作用激活內(nèi)源性通路。

細胞凋亡的檢測方法

細胞生命的終結(jié)有許多種方式，凋亡只是其中一種，所以要確保自己檢測到的的確是凋亡信號。

細胞凋亡的檢測方法也有多種，如形態(tài)學(xué)檢測、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V 法）、線粒體膜勢能檢測、DNA 片斷化檢測、TUNEL 法及 Caspase-3 活性檢測等，可根據(jù)自己的實驗需求選擇合適的方法。這里我們主要了解 Annexin V 法。

Annexin V 是一種分子量為 35～36 KD 的豐富的胞內(nèi)蛋白。Annexin V 屬于 Ca²⁺結(jié)合蛋白家族，可與磷脂（PL）發(fā)生可逆的 Ca²⁺ 依賴性結(jié)合，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高親和力。在健康細胞中，PS 主要位于質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)，而在早期凋亡細胞中，PS 從質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至外側(cè)，Annexin V 與暴露在細胞外環(huán)境的 PS 結(jié)合。

核酸染料碘化丙啶（PI）及 7 氨基-放線菌素 D（7-AAD）均具有高 DNA 結(jié)合常數(shù)，它們不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染色。因此，將 Annexin V 與 PI 或 7-AAD 聯(lián)合使用，可以將凋亡早、晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

Annexin V 可以與熒光素（FITC、PE）或 biotin 綴合，這種形式保留了 Annexin V 對 PS 的高親和力，因此可以用流式細胞術(shù)或熒光顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生。與 PI 不同，7-AAD 與 PE 和 FITC 的光譜重疊最小，因此，可以在多色分析中與 PE 和 FITC 標記的抗體聯(lián)合使用。

圖 1. Annexin V/7-AAD 凋亡檢測原理示意圖

以 7-AAD 為例（見上圖），在早期細胞凋亡中，用 Annexin V 染色可以區(qū)分早期凋亡細胞（Annexin V 陽性，7-AAD 陰性）。在晚期細胞凋亡中，細胞膜喪失完整性，7-AAD 可以與 DNA 結(jié)合（Annexin V 陽性，7-AAD 陽性）。

然而，該方法不能區(qū)分凋亡細胞和壞死細胞，在任一情況下，死細胞都會被 Annexin V 和 7-AAD 染色。

細胞凋亡檢測的意義

細胞凋亡與疾病發(fā)生存在密切的關(guān)系，細胞凋亡不足或過度均會導(dǎo)致一系列疾病。如，腫瘤細胞凋亡抑制基因或凋亡活化基因表達異常，細胞死亡不足會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生；負選擇機制失調(diào)，針對自身抗原的 T 細胞未能通過細胞凋亡而被清除，進而攻擊自身組織，產(chǎn)生自身免疫?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡）。

細胞凋亡過度可導(dǎo)致心血管疾病、神經(jīng)元退行性疾病及病毒感染（如 AIDS，某些 T 細胞過度凋亡）等疾病的發(fā)生。

細胞凋亡不足與過度并存也可引起一系列疾病，如動脈粥樣硬化時，內(nèi)皮細胞凋亡過度，平滑肌細胞凋亡不足等。所以，加強對細胞凋亡的檢測在臨床疾病檢測與治療中具有重要意義。

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