失眠已經(jīng)成為影響現(xiàn)代人健康的重要問題之一，據(jù)調(diào)查，我國約47.2%的老年人存在不同形式的睡眠障礙，并且這一問題呈現(xiàn)出逐年年輕化的趨勢^[1]。失眠不僅會(huì)誘導(dǎo)情緒的過度興奮（焦慮、反叛和心境惡劣的人格特質(zhì)），而且與精神疾病高度共存，是產(chǎn)生抑郁和自殺傾向的重要誘導(dǎo)因素^[2-3]。目前臨床治療失眠的藥物主要包括苯二氮?類藥物（三唑侖、艾司唑侖、硝基安定等）、褪黑素受體激動(dòng)劑和具有催眠效果的抗抑郁藥物^[4]。

苯二氮?類藥物主要與苯二氮受體結(jié)合發(fā)揮作用，可增強(qiáng)γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)的功能，促進(jìn)Cl離子內(nèi)流，使神經(jīng)細(xì)胞膜超極化。由于苯二氮?類藥物彌散性地抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，常帶來戒斷綜合癥和白天殘留效應(yīng)等副作用^[4]，而褪黑素受體激動(dòng)劑如褪黑素容易產(chǎn)生耐藥性和藥物依賴^[5]。近年來，神經(jīng)解剖學(xué)、藥理學(xué)和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)多巴胺（DA）能神經(jīng)元與睡眠覺醒腦區(qū)間有著廣泛的纖維聯(lián)系，臨床常用的以DA受體為靶點(diǎn)的抗精神病藥物都具有良好的鎮(zhèn)靜安神作用，如DA受體D₁拮抗劑氯氮平以及FDA批準(zhǔn)的2個(gè)DA受體

本研究利用經(jīng)典的小鼠睡眠實(shí)驗(yàn)探討天麻對(duì)睡眠的促進(jìn)作用及其對(duì)中樞DA系統(tǒng)的影響，并進(jìn)一步研究天麻有效成分天麻素通過影響DA通路發(fā)揮作用的機(jī)制，為研究天麻對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1  材料

1.1  動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滇）K2015-0002，飼養(yǎng)于昆明理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室溫度為（25.0±0.5）℃，采用全價(jià)營養(yǎng)顆粒鼠飼料，動(dòng)物自由取食、飲水。源自人胚胎腎細(xì)胞的Flp-in^TM T-Rex^TM HEK293細(xì)胞購自Invitrogen公司。

1.2  藥品與試劑

天麻于2018年4月25日購自云南省昭通市藥材市場，為2017年12月采收，經(jīng)昆明理工大學(xué)生科院郝倩博士鑒定為昭通烏天麻Gastrodia elata Bl. f. glauca S. Chow.的干燥塊莖；戊巴比妥鈉（山東西亞化學(xué)股份有限公司，批號(hào)F074）；艾司唑侖片（常州四藥制藥有限公司，批號(hào)20170812）；特級(jí)初榨橄欖油（Olitalia公司）；生理鹽水（昆明南疆制藥有限公司）；第一鏈cDNA合成試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，）；qRT-PCR DNA熒光染料（Roche公司）；小鼠多巴胺ELISA試劑盒（Mlbio公司）；胎

1.3  儀器

高速離心機(jī)（Labogene公司）；微量移液槍（Gilson公司）；通用手術(shù)器械（上海醫(yī)療器械有限公司）；BX-50奧林巴斯顯微鏡（Olympus公司）；電子天平（Ohaus公司）；酶標(biāo)儀（Bmglabtec公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（Roche公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器有限公司）。

2  方法

2.1  藥品配制

稱取天麻粉（全天麻烘干超微粉碎制得）0.24 g混勻于4 mL生理鹽水中制成0.6 g/mL混懸液待用。稱取天麻粉0.24 g，加入1 mL橄欖油和3 mL生理鹽水，制成含25%橄欖油的天麻粉混懸液，備用。稱取0.4 mg艾司唑侖粉末，加入4 mL生理鹽水制成0.1 mg/mL的混懸液備用。取1 mL橄欖油與3 mL生理鹽水，使用時(shí)混勻吸取。

2.2  分組與給藥

將50只小鼠隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組、天麻組、橄欖油組、天麻-橄欖油組及陽性對(duì)照艾司唑侖組，每組10只，雌雄各半。對(duì)照組小鼠每只ig給予生理鹽水0.4 mL，天麻組小鼠ig給予溶于生理鹽水的天麻粉1.2 g/kg^[13]，橄欖油組小鼠每只ig給予25%橄欖油生理鹽水混懸液0.4 mL，天麻-橄欖油組小鼠每只ig給予含25%橄欖油的天麻粉混懸液1.2 g/kg，艾司唑侖組小鼠ig給予2 mg/kg的艾司唑侖，連續(xù)給藥20 d。各組小鼠分別在第7、20天給藥30～40 min后ip最大閾下劑量戊巴比妥鈉（35 mg/kg），測定睡眠發(fā)生率（以翻正反射消失為進(jìn)入睡眠）；分別在第8天給藥30～40 min后及第21天ip最小閾上劑量戊巴比妥鈉（50mg/kg），檢測小鼠睡眠潛伏期（從注射戊巴比妥鈉到小鼠翻正反射消失的時(shí)間段）和睡眠時(shí)長（翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)的時(shí)間段）。

2.3  qRT-PCR檢測多巴胺受體各亞型mRNA表達(dá) 

利用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物并利用NCBI的Primer Blast功能驗(yàn)證引物特異性，引物序列見表1。連續(xù)給藥20 d，測定小鼠各項(xiàng)睡眠指標(biāo)后頸椎脫臼法處死小鼠并取全腦勻漿，稱取全腦勻漿約0.1 g，用1 mL Trizol裂解，提取總RNA并及時(shí)反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于qRT-PCR。以cDNA為模板配制成20 μL的反應(yīng)體系，使用RocheLight Cycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行測定，具體反應(yīng)條件為： 95 ℃、10 min預(yù)變性，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共40個(gè)循環(huán)。采用

2.4  ELISA法檢測小鼠腦組織DA水平

頸椎脫臼法處死小鼠并稱取約0.1 g的小鼠全腦于0.8 mL 1×PBS中快速混勻，并充分渦旋使遞質(zhì)溶出，5 000×g離心10 min，取上清按照試劑盒說明書采用ELISA法檢測DA水平。

2.5  Western blotting法檢測DA受體D₁、D₂誘導(dǎo)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

利用Flp-in T-Rex HEK293?系統(tǒng)，將含有D₁和D₂編碼序列的誘導(dǎo)表達(dá)載體pCDNA5/FRT/TO- VSV-GluR5-D₁/D₂與可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過表達(dá)整合酶的pOG44載體共轉(zhuǎn)染Flp-in T-Rex HEK293細(xì)胞，并用潮霉素篩選，得到由多西環(huán)素（DOX）誘導(dǎo)表達(dá)多巴胺受體D₁和D₂的穩(wěn)定細(xì)胞株。

用DOX以終質(zhì)量濃度10 ng/mL誘導(dǎo)上述穩(wěn)定株24 h，血清饑餓12 h，分別使用0.001、0.100、10.000 nmol/L的天麻素分別處理D₁和D₂細(xì)胞（分別都以空載體細(xì)胞為陰性對(duì)照）各5 min，以DA受體激動(dòng)劑多巴胺鹽酸鹽（100 nmol/L）作為陽性對(duì)照。在上述處理過的細(xì)胞中加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分裂解細(xì)胞，蛋白定量，與SDS上樣緩沖液混勻，利用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以5%脫脂牛奶封閉。用一抗（VSV、ERK1/2和pERK1/2抗體）分別孵育2 h。TBST/T洗膜3次，相應(yīng)二抗孵育1 h。TBST/T洗膜3次。最后配制化學(xué)發(fā)光底物，并在化學(xué)發(fā)光儀上對(duì)靶蛋白條帶進(jìn)行曝光顯影。

2.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS Statistics 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

3  結(jié)果

3.1  天麻對(duì)小鼠睡眠的影響

3.2  天麻對(duì)小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA水平的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，天麻組和天麻-橄欖油組小鼠腦內(nèi)DA水平均顯著提高，天麻-橄欖油組DA水平上調(diào)幅度更為明顯（P＜0.01、0.001，圖2）。天麻-橄欖油組相對(duì)于橄欖油組小鼠腦內(nèi)DA含量提高約36%，高于天麻組相對(duì)于對(duì)照組的提高幅度（約25%）。陽性對(duì)照艾司唑侖組小鼠腦內(nèi)DA水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.001，圖2）。

3.3  天麻對(duì)DA受體各亞型表達(dá)的影響

采用qRT-PCR法檢測小鼠腦內(nèi)D₁～D₅的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，天麻顯著提高了小鼠大腦中樞各個(gè)亞型DA受體的表達(dá)（圖3），且其效果優(yōu)于艾司唑侖。同時(shí)，各組小鼠各個(gè)亞型DA受體的上調(diào)趨勢一致。提示天麻在促進(jìn)小鼠睡眠過程中，D₁樣受體和D₂樣受體可能均參與了調(diào)控，而天麻水溶性成分（如天麻素）可能扮演了更重要的角色。

3.4  天麻素對(duì)ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為觀察天麻素對(duì)DA受體介導(dǎo)的通路的作用，采用Westwenblotting法檢測ERK通路的效應(yīng)蛋白ERK1/2及p-ERK1/2表達(dá)水平。結(jié)果（圖4）顯示，與對(duì)照組比較，天麻素可以通過DA受體D₂激活ERK1/2，顯著提高p-ERK1/2水平，效果與多巴胺鹽酸鹽相當(dāng)，但劑量依賴不明顯。而天麻素對(duì)D₁受體介導(dǎo)的ERK1/2通路激活作用并不明顯。提示天麻素可能主要通過D₂受體激活ERK1/2通路發(fā)揮睡眠調(diào)控作用。

4  討論

中樞的DA系統(tǒng)是調(diào)控睡眠和覺醒的重要組分^[14]。D₁和D₂都可以被DA激活，從而激活下游信號(hào)通路，其中ERK1/2是D₁和D₂通路的重要分子標(biāo)記^[15-16]。激動(dòng)劑可通過D₁ 或D₂激活效應(yīng)蛋白ERK1/2，提高ERK1/2磷酸化水平^[15-16]。ERK1/2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能在生理和病理?xiàng)l件下參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻能夠提高小鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)DA水平，并上調(diào)各個(gè)亞型DA受體的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)睡眠的作用，這些作用可能部分由天麻中水溶性成分天麻素通過D₂激活ERK1/2通路來實(shí)現(xiàn)。

-橄欖油組小鼠的睡眠潛伏期顯著縮短，天麻組小鼠睡眠時(shí)長顯著增加，提示天麻中脂溶性成分可能具有加速入眠的功能，而水溶性成分可能具有延長睡眠時(shí)間的作用。

失眠作為一種原發(fā)性或繼發(fā)性睡眠障礙，其發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、睡眠相關(guān)受體表達(dá)失常、生活壓力過大等一系列因素相關(guān)。DA作為哺乳動(dòng)物腦內(nèi)含量最多的神經(jīng)遞質(zhì)之一，參與了機(jī)體睡眠-覺醒、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知行為和正性強(qiáng)化等多項(xiàng)功能的調(diào)控。郝晉東等^[18]發(fā)現(xiàn)天麻素可提高大鼠紋狀體多巴胺含量，龐宇涵等^[19]發(fā)現(xiàn)人參益智膠囊可提高小鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素（NE）、DA、5-羥色胺（5-HT）含量，改善小鼠的睡眠。本研究結(jié)果表明，天麻可顯著提高小鼠腦部DA水平，同時(shí)發(fā)現(xiàn)DA受體各亞型的表達(dá)量也有顯著提高，因?yàn)橹心X邊緣DA系統(tǒng)具有調(diào)控興奮和鎮(zhèn)靜的雙重作用^[20]，且哺乳動(dòng)物的睡眠還受到γ-氨基丁酸A型受體（GABAa）、Melatonin、5-HT、Orexin等多種受體的調(diào)控。本研究初步證明天麻可提高中樞DA系統(tǒng)的活力，但其不同于褪黑素系統(tǒng)發(fā)揮的快速促睡眠功效^[21]，天麻中的有效成分能夠以一個(gè)較為緩慢的過程發(fā)揮促睡眠作用。更為確切的調(diào)控機(jī)制還需深入研究。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)橄欖油也可提高小鼠腦內(nèi)DA水平和DA受體表達(dá)量，推測這可能是橄欖油在抗衰老與益智健腦方面作用的機(jī)制之一^[22]。

參考文獻(xiàn)（略） 

來  源：胡鵬程，王  進(jìn)，李墨香，劉  瑩，郭曉汐，郝  倩，安  輸，徐天瑞，楊  洋. 天麻改善小鼠睡眠作用及其機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(13):3140-3146.