1范 圍

2規(guī)范性引用文件

3術(shù)語和定義

4原  理

所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑：水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水；試劑和材料包括：

a)正已烷。

b)乙酸乙酯。

c)乙腈：HPLC級。

d)甲酸：優(yōu)級純。

e)乙酸銨：色譜純。

f)冰乙酸：優(yōu)級純。

g)20mmol/L乙酸溶液：取乙酸銨1.54g1000mL量瓶中，加水適量，加入甲酸2.0mL加水至刻度，搖勻。

h)1mol/L氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉4.0g，加水100mL溶解。

i)1mol/L鹽酸溶液：取濃鹽酸20.8mL，加水稀釋至250mL。

j) △⁹ 四氫大麻酸對照品溶液：市售100g/m甲溶液，置冰箱中冷凍保存。保存時間為12個月。              

k) △⁹ 四氫大麻酸對照品工作溶液：試驗中所用其他濃度的對照品溶液均從上述對照品溶液用甲醇稀釋得到，密封，置于冰箱中冷藏保存，保存時間為3個月。

l)內(nèi)標物△⁹ 四氫大麻酸-d₉對照品溶液；市售00g/mL甲溶液，冰箱中冷凍保存。保存時間為12個月。

m)內(nèi)標物△⁹ 四氫大麻酸-d。對照品工作溶液；內(nèi)標對照品溶液用甲醇稀釋，配制成10pg/mL的工作溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存。保存時間為3個月。

n)具塞玻璃試管。

o)精密pH試紙。

儀器設備包括：

a)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)。

b)渦旋振蕩器。

c)離心機。

d)恒溫水浴鍋。

e)精密移液器：10μL ~100μL、100μL ~1000μL 。

f)電子天平。

7.1 定性分析

7.1.1 樣品提取

精密量取待測樣品尿液1mL，加入1mL的1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至pH13，80℃水浴中水解30min，冷卻后加入1mL的1mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH7~8，再加入100μL冰乙酸，調(diào)至pH4~5，加入3mL正已烷：乙酸乙酯(9：1)，混旋，離心吸取上清液，60℃水浴空氣流下吹干，殘留物中加入200μL乙腈：20mmol/L乙酸銨溶液(9：1)定容，取5μL供LC-MS/MS檢測。

7.1.2 添加樣品及空白樣品

取空白尿液樣品1mL兩份，一份添加△⁹ 四氫大麻酸工作溶液制得15ng/mL添加樣品，一份做陰性對照，按上述操作與待測樣品平行提取和分析。

7.1.3 儀器檢測

7.1.3.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀參考條件

以下為參考條件，按照本法所獲得的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖參見附錄A中的圖A.1，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實際情況進行調(diào)整：

a)色譜柱：MG II C18，3μm，50mm×3mm(內(nèi)徑)或相當者；

b)柱溫：室溫；

c)流動相：乙腈：20mmol/L乙酸胺和0.1%甲酸緩沖液(9：1)；

d)流速：200μL/min；

e)進樣量：5μL；

f)離子源：ESI，負離子模式；

g)離子噴霧電壓：4000V；

h)離子源溫度：450℃；

i)檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；

j)碰撞氣、氣簾氣等氣流值應優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；

k) △⁹ 四氫大麻酸和內(nèi)標物的定性離子對、定量離子對、去簇電壓和碰撞能量見表1。

7.1.3.2 進樣

分別吸取待測樣品、空白和添加樣品提取液，按7.1.3.1條件進樣分析。

7.1.3.3 記錄和計算

記錄各得測樣品及添加樣品平行進樣后△⁹ 四氫大麻酸的保留時間及峰面積值。

在相同的試驗條件下，待測樣品中出現(xiàn)兩對定性離子對色譜峰，其保留時間與添加樣品中△⁹ 四大麻酸保留時間比較，相對誤差在士2.5%內(nèi)，且相對離子對豐度比與質(zhì)量濃度相近添加樣品中的相對離子對豐度比之相對誤差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在△⁹ 四氫大麻酸。

7.2 定量分析

7.2.1 樣品提取

取待測樣品1mL兩份，加入10μL內(nèi)標工作溶液，余下同7.1.1。

另取空白樣品兩份，根據(jù)待測樣品中△⁹ 四氫大麻酸的質(zhì)量濃度情況添加系列質(zhì)量濃度的△⁹ 四氧大麻酸，作為添加樣品，與待測樣品平行操作待測樣品中△⁹ 四氫大麻酸的質(zhì)量濃度應在工作曲線的線性范圍內(nèi)。

7.2.2 儀器檢測

儀器參考條件同7.1.3.1。

7.2.3 進樣

分別取待測樣品、系列質(zhì)量濃度的添加樣品，按7.1，3.1條件進樣分析。

7.2.4 記錄與計算

在系列濃度的△⁹ 四氫大麻酸添加樣品中以△⁹ 四氫大麻酸與內(nèi)標物定量離子對的峰面積比(Y) 為縱坐標、△⁹ 四氫大麻酸質(zhì)量濃度(C)為橫坐標進行線性回歸，得線性方程。

根據(jù)待測樣品中△⁹ 四氫大麻酸及內(nèi)標物定量離子對的峰面積值，按式(1)計算出待測樣品中△⁹ 四氫大麻酸的質(zhì)量濃度?！?sup>9 四氫大麻酸的線性準確度和精密度的試驗數(shù)據(jù)參見附錄B中的表B.1和表B.2。

7.2.5 平行試驗

待樣品同時平行測定兩份，雙樣相對相差按式(2)計算：

8.1 定性結(jié)果評價

8.1.1 陰性結(jié)果評價

若添加樣品中檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，待測樣品中未檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，則陰性結(jié)果可靠若添加樣品中未檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，則陰性結(jié)果不可靠。

8.1.2 陽性結(jié)果評價

若待測樣品中檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，且空白樣品無干擾，則陽性結(jié)果可靠；若待測樣品中檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，且空白樣品亦呈陽性，則陽性結(jié)果不可靠。

8.2 定量結(jié)果評價

若待測樣品中△⁹ 四氫大麻酸質(zhì)量濃度的雙樣相對相差小于或等于20%，定量數(shù)據(jù)可靠，其質(zhì)量濃度按兩份樣品的平均值計算。若待測樣品中△⁹ 四氫大麻酸質(zhì)量濃度的雙樣相對相差大于20%，定量數(shù)據(jù)不可靠，應按7.2重新提取檢驗。

8.3 檢出限和定量下限

本標準尿液中△⁹ 四氫大麻酸的檢出限為4ng/mL，定量下限為10ng/mL。

（資料性附錄） △⁹ 四氫大麻酸的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖  見圖A.1

（資料性附錄） 線性、精密度和準確度