前 言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)司法部歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：向平、卓先義、沈保華、劉偉、卜俊、馬棟、嚴(yán)慧。

尿液中Δ9-四氫大麻酸的測(cè)定

1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了尿液中Δ9-四氫大麻酸的測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于尿液中Δ9-四氫大麻酸的測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限為50ng/mL。

2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法（ GB/T 6682-2008， ISO 3696： 1987， MOD）
GA/T 122 毒物分析名詞術(shù)語(yǔ)

第一篇 免疫篩選法

3 原理
該法采用高度特異性的抗原-抗體反應(yīng)的免疫膠體金層析技術(shù)，通過(guò)單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Δ9-四氫大麻酸偶聯(lián)物和尿液中可能含有的Δ9-四氫大麻酸的原理，試劑盒含有被事先固定于膜上測(cè)試區(qū)（ T）的Δ9-四氫大麻酸偶聯(lián)物和被膠體金標(biāo)記的抗Δ9-四氫大麻酸單克隆抗體。

4 試劑
Δ9-四氫大麻酸尿液膠體金法試劑盒（ THC-COOH）。

5 操作方法
用吸管吸取尿液尿液，滴入試劑盒的樣品孔中 5 滴（約 150～200μL），３～５min 后觀察結(jié)果。

6 結(jié)果判定
6.1 陽(yáng)性
僅質(zhì)控區(qū) C 出現(xiàn)紫紅色帶，而測(cè)試區(qū) T 無(wú)紫紅色帶，表明尿液中Δ9-四氫大麻酸濃度在50ng/mL 以上。
6.2 陰性
質(zhì)控區(qū) C 及測(cè)試區(qū) T 均出現(xiàn)紫紅色帶，表明尿液中Δ9-四氫大麻酸濃度在 50ng/mL 以下。
6.3 無(wú)效
質(zhì)控區(qū) C 未出現(xiàn)紫紅色帶，結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新檢驗(yàn)。

第二篇 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

7 原理

本法利用Δ9-四氫大麻酸在體內(nèi)形成葡萄糖醛酸結(jié)合物的特點(diǎn)，在堿性條件下尿液水解，然后在酸性條件下用有機(jī)溶劑提出，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性分析。

8 試劑和材料
除方法另有規(guī)定外，試劑均為分析純，試驗(yàn)室用水符合 GB/T6682 規(guī)定的一級(jí)水。
8.1 Δ9-四氫大麻酸對(duì)照液
Δ9-四氫大麻酸對(duì)照溶液濃度為 50μg/mL。試驗(yàn)中所用其它濃度的對(duì)照溶液均從上述對(duì)照溶液稀釋而得，儲(chǔ)存在 4℃ 冰箱中，保存期為 6 個(gè)月。
8.2 40%氫氧化鈉溶液。
8.3 1mol/L 鹽酸溶液。
8.4 冰醋酸。
8.5 正己烷。
8.6 乙酸乙酯。
8.7 甲酸
優(yōu)級(jí)純。
8.8 乙腈
色譜純。
8.9 乙酸胺
色譜純。
8.10 流動(dòng)相緩沖液
20mmol/L 乙酸銨和 0.1%甲酸緩沖液：分別稱取 1.54g 乙酸銨和 1.84g 甲酸置于 1000mL容量瓶中，加水定容至刻度， pH 值約為 4。

9 儀器
9.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀
配有電噴霧離子源（ ESI）。
9.2 旋渦混合器。
9.3 離心機(jī)。
9.4 恒溫水浴鍋。
9.5 移液器。
9.6 具塞離心試管。

10 測(cè)定步驟
10.1 樣品預(yù)處理
尿液 2mL 加入 40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH>13，80°C 水浴中水解 30min，冷卻后加入 1mol/L鹽酸溶液至 pH4-5，再加入 0.5mL 冰醋酸和 3mL 正己烷:乙酸乙酯(9:1)，混旋，離心，取上清液，60°C 水浴中揮干，加入 100μL 乙腈:流動(dòng)相緩沖液(90:10)溶解，取 5μL 進(jìn)樣 LC-MS/MS。
10.2 測(cè)定
10.2.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件
a) 液相柱： Ultra IBD 柱(50mm×2.1mm×5μm)或相當(dāng)者，前接 C18 保護(hù)柱；
b) 柱溫：室溫；
c) 流動(dòng)相： V(乙腈): V(20mmol 乙酸胺和 0.1%甲酸緩沖液)=90: 10；
d) 流速： 200μL/min；
e) 進(jìn)樣量： 5μL；
f) 離子源：電噴霧電離-負(fù)離子模式(ESI-)；
g) 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；
h) 定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)和保留時(shí)間（tR）見表 1。

10.2.2定性測(cè)定

進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果檢出的色譜峰保留時(shí)間與空白檢材添加對(duì)照品的色譜峰保留時(shí)間比較，相對(duì)誤差小于 2%，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，均出現(xiàn)所選擇的離子對(duì)，而且所選擇的離子對(duì)相對(duì)豐度比與添加對(duì)照品的離子對(duì)相對(duì)豐度比之相對(duì)誤差不超過(guò)表 2 規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在這種化合物。

10.3 空白試驗(yàn)
除以相同基質(zhì)空白替代檢材外，均按上述步驟進(jìn)行。

附 錄 A

（資料性附錄）

Δ9-四氫大麻酸的二級(jí)質(zhì)譜圖