奧沙利鉑抗性是治療晚期結(jié)直腸癌（CRC）的主要挑戰(zhàn)，EMT的獲得和癌細胞中抑制的藥物積累都有助于奧沙利鉑抗性的發(fā)展。小的非編碼RNA miR-128-3p的異常表達已證明是腫瘤發(fā)生和癌癥發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，其在CRC和奧沙利鉑抗性進展中的作用在很大程度上是未知的。3月19日山東大學第二醫(yī)院檢驗科團隊在Molecular Cancer上發(fā)表了“Exosome-transmitted miR-128-3p increase chemosensitivity of oxaliplatin-resistant colorectal cancer”，在建立穩(wěn)定的奧沙利鉑抗性CRC細胞系中，體外和體內(nèi)研究顯示miR-128-3p抑制EMT并增加細胞內(nèi)奧沙利鉑積累。重要的是較低的miR-128-3p表達與晚期人CRC患者中較差的奧沙利鉑反應(yīng)相關(guān)。此外，數(shù)據(jù)顯示miR-128-3p轉(zhuǎn)染的FHC細胞有效地將miR-128-3p包裝到分泌的外泌體中并介導(dǎo)miR-128-3p遞送至奧沙利鉑抗性細胞，從而改善體外和體內(nèi)CRC細胞中的奧沙利鉑反應(yīng)。此外，miR-128-3p過表達通過抑制耐藥細胞中的Bmi1表達來上調(diào)E-鈣粘蛋白水平并抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的EMT。同時，它還通過抑制藥物轉(zhuǎn)運蛋白MRP5的表達降低奧沙利鉑流出量。結(jié)果表明，通過外泌體遞送miR-128-3p代表了通過Bmi1和MRP5的負調(diào)節(jié)增強CRC中的化學敏感性的新策略。此外，miR-128-3p可能是基于奧沙利鉑化療的有希望的診斷和預(yù)后標志物。

Figure 1：奧沙利鉑耐藥的HCT116OxR和HT29OxR細胞經(jīng)歷了EMT并增加了藥物外排。 a模型表示獲得耐奧沙利鉑的CRC細胞的過程。 b母體和抗性細胞系的CCK8測定，然后以指定濃度進行奧沙利鉑處理。 c流式細胞術(shù)用于奧沙利鉑處理的親本和抗性細胞的凋亡測定。 d HCT116，HCT116-OxR，HT29和HT29OxR細胞的形態(tài)。 e通過Transwell測定評估親本和抗性CRC細胞的遷移和侵襲能力。 f通過傷口愈合測定評估親本和抗性CRC細胞的運動能力。 gE-cad，N-cad，Vim和Fn在親本和抗性CRC細胞中的蛋白質(zhì)印跡分析。 h-i暴露于奧沙利鉑處理后，親代和抗性細胞中Pt的積累及總Pt-DNA加合物水平。 j奧沙利鉑暴露后母體和耐藥細胞中奧沙利鉑誘導(dǎo)γ-H2AX表達的核灶免疫熒光分析。

Figure 2：miR-128-3p在CRC細胞系中的表達及其對奧沙利鉑耐藥的影響。 a-b進行RT-qPCR測定以檢測親本和抗性CRC細胞中的miR-128-3p表達及用Lv-128和Ctrl轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞中的miR-128-3p表達。 c用指定濃度的Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞和用奧沙利鉑處理的Ctrl的CCK8測定。 d流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染Lv-128和Ctrl的奧沙利鉑治療HCT116OxR細胞。 e轉(zhuǎn)染Lv-128和Ctrl的HCT116OxR細胞中E-cad，N-cad，Vim和Fn表達的Western印跡分析。 f通過Transwell試驗評估轉(zhuǎn)染Lv-128和Ctrl的HCT116OxR細胞的遷移和侵襲能力。 g通過傷口愈合測定評估用Lv-128和Ctrl轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞的運動能力。 h-i在暴露于奧沙利鉑處理后，用Lv-128和Ctrl轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞中Pt的累積、總Pt-DNA加合物水平以及核灶的γ-H2AX表達的免疫熒光分析。 （k）顯示腫瘤體積和代表性生物發(fā)光圖像.

Figure 3：miR-128-3p的表達水平與CRC患者中奧沙利鉑治療反應(yīng)相關(guān). a RT-qPCR分析來自健康供體和治療初始的患者的CRC組織中的miR-128-3p，受益于新輔助奧沙利鉑治療并且在奧沙利鉑治療期間復(fù)發(fā)。 b在奧沙利鉑治療期間，非PD或PD的CRC患者的治療前組織中miR-128-3p的RT-qPCR分析。 c通過AUC評估的使用miR-128-3p檢測奧沙利鉑的ROC曲線。有或沒有奧沙利鉑治療的CRC患者PFS的Kaplan-Meier生存曲線分析。 d所有患者;即miR-128-3p表達低的患者. F miR-128-3p表達高的患者。

Figure 4：來自miR-128-3p轉(zhuǎn)染的FHC細胞的外泌體的表征和作用。 aTEM分析外泌體，其顯示相同的形態(tài)。NTA分析了來自FHC細胞的外泌體的大小分布和數(shù)量。 b蛋白質(zhì)印跡分析顯示外泌體富集的培養(yǎng)基，其具有CD63和CD9的外泌體標記物的表達以及順式-高爾基體基質(zhì)蛋白的非表達。 cRT-qPCR檢測來自用Lv-128和Ctrl轉(zhuǎn)染的FHC細胞的外泌體中的miR-128-3p表達。 d用RNase A和/或Triton X-100處理128-exo共培養(yǎng)細胞中miR-128-3p的RT-qPCR分析，然后進一步與RNase抑制劑混合。 e來自FHC-128細胞的外泌體的內(nèi)化。 f用PBS，NC-exo，128-exo，128-exo處理的受體HCT116OxR細胞中的miR-128-3p的RT-qPCR分析。 g在128-exo的不同孵育時間共培養(yǎng)的受體HCT116OxR細胞中miR-128-3p的RT-qPCR分析。 h用放線菌素D處理的HCT116OxR細胞中miR-128-3p的RT-qPCR分析，然后128-exo處理。

Figure 5：通過128-Exo細胞間轉(zhuǎn)移miR-128-3p使CRC細胞對奧沙利鉑試劑敏感。 a用指定因子預(yù)溫育的HCT116OxR細胞的CCK8測定，然后以指定濃度進行奧沙利鉑處理。 b用于凋亡測定的HCT116OxR細胞的流式細胞術(shù)。 c用指定因子孵育后HCT116OxR細胞中蛋白質(zhì)E-cad，N-cad，Vim和Fn表達的Western印跡分析。 d通過Transwell測定評估用指定因子孵育后HCT116OxR細胞的遷移和侵襲能力。 e通過傷口愈合測定法測定HCT116OxR細胞在用指定因子孵育后的運動能力。 f-g在暴露于奧沙利鉑處理后，與指定因子一起孵育后，HCT116OxR細胞中Pt的累積及總Pt-DNA加合物水平。  h針對γ-H2AX表達的核灶的免疫熒光分析將HCT116OxR細胞與指定因子一起孵育，然后暴露奧沙利鉑。 i在裸鼠中用載體或奧沙利鉑處理的裸鼠中瘤內(nèi)注射PBS，128-exo和exo/FHC miR-128-3p電極對裸鼠中的HCT116OxR細胞進行皮下異種移植測定。（i）顯示腫瘤體積。（j）代表性生物發(fā)光圖像.

Figure 6：含有miR-128-3p的外泌體通過靶向Bmi1和MRP5使CRC細胞對奧沙利鉑敏感。 aBmi1和MRP5 mRNA 3'-UTR區(qū)域中推定的預(yù)測的miR-128-3p結(jié)合位點。 b-cSpearman對CRC組織中Bmi1 mRNA、MRP5 mRNA與miR-128-3p的相關(guān)性分析。 d在不同條件下對Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞進行CCK8測定。 e流式細胞儀檢測Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞在不同條件下的細胞凋亡。 f蛋白質(zhì)印跡分析Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT11 6OxR細胞在不同條件下的蛋白質(zhì)Bmi1，E-cad，N-cad，Vim和Fn表達。通過Transwell測定評估Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT11 6OxR細胞在不同條件下的遷移和侵襲能力。 h通過傷口愈合測定法測定Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT11 6OxR細胞在不同條件下的運動能力。 i蛋白質(zhì)印跡分析Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞在不同條件下的蛋白質(zhì)MRP5表達。 j-k暴露于奧沙利鉑處理后，在不同條件下Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞中Pt的積累和總Pt-DNA加合物水平。  l 奧沙利鉑暴露后，不同條件下Lv-128轉(zhuǎn)染的HCT116OxR細胞的γ-H2AX表達的核灶的免疫熒光分析。 m用指定因子孵育后HCT116OxR細胞中蛋白質(zhì)Bmi1和MRP5表達的蛋白質(zhì)印跡分析。 n瘤內(nèi)注射NC-exo和128-exo對異種移植瘤組織中Bmi1和MRP5蛋白水平的免疫組織化學分析。

目前，產(chǎn)生奧沙利鉑抗性的晚期CRC患者具有有限的治療選擇。因此，有必要研究奧沙利鉑耐藥的生物學基礎(chǔ)，并確定新的治療靶點和奧沙利鉑耐藥的預(yù)防策略。該研究將miR-128-3p鑒定為重要的抗腫瘤microRNA和腫瘤進展抑制劑。miR-128-3p在奧沙利鉑抗性CRC中下調(diào)，并且在功能上需要抑制耐藥表型。miR-128-3p過表達通過競爭性結(jié)合Bmi1和MRP5 mRNA 3'-UTR重新敏化奧沙利鉑反應(yīng)，導(dǎo)致奧沙利鉑抗性CRC細胞的間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變和減少的細胞奧沙利鉑流出。還展示了一種新的策略，即使用外泌體將治療性miR-128-3p轉(zhuǎn)移到抗性CRC細胞中來增加CRC化學敏感性。miR-128-3p修飾的FHC細胞有效地將miR-128-3p包裝到分泌的外泌體中，并介導(dǎo)miR-128-3p轉(zhuǎn)移至耐奧沙利鉑的CRC細胞。因此，通過改變Bmi1和MRP5表達使抗性CRC細胞對化學治療劑更敏感。

基于miR-128-3p的外顯子信號通路在CRC治療中示意圖。在奧沙利鉑耐藥的CRC細胞中，來自FHC-128細胞的外泌體miR-128-3p通過競爭性結(jié)合Bmi1和MRP5逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑抗性，導(dǎo)致E-鈣粘蛋白表達增加并減少奧沙利鉑外排。

Mir-128被描述為腫瘤抑制因子，并且在膠質(zhì)母細胞瘤中首次發(fā)現(xiàn)miR-128水平降低。最近研究表明，在一些惡性癌細胞表型中觀察到異常的miR-128-3p表達。文章通過強調(diào)miR-128-3p在化療耐藥CRC中的作用來擴展當前的知識。結(jié)果表明，CRC腫瘤組織和細胞系中的miR-128-3p表達水平顯著低于正常組織和細胞系。另外，與敏感細胞相比，在奧沙利鉑抗性細胞中鑒定出下調(diào)的miR-128-3p。因此，推測miR-128-3p可能在奧沙利鉑抗性CRC中起重要作用。

了解CRC中的耐藥機制對于優(yōu)化當前的治療策略至關(guān)重要，通過關(guān)注可能的分子靶標探索了miR-128-3p介導(dǎo)的化學抗性逆轉(zhuǎn)的潛在機制。文章確定polycomb組蛋白Bmi1作為miR-128-3p的功能靶標來調(diào)節(jié)EMT。在之前的研究中，Bmi1在CRC中高表達，是診斷和預(yù)后的潛在生物標志物。與Bmi1在頭部和頸部鱗狀細胞癌中通過抑制E-鈣粘蛋白表達的Twist1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中必需的觀察結(jié)果一致，研究發(fā)現(xiàn)miR-128-3p正調(diào)節(jié)E-cadherin的表達。因此，由于miR-128-3p減少導(dǎo)致的Bmi1過表達可能通過該途徑導(dǎo)致CRC中的化療誘導(dǎo)的EMT。

此外，發(fā)現(xiàn)作為ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員的MRP5也是miR-128-3p的靶標。人類ABC基因編碼ATP依賴性轉(zhuǎn)運蛋白，可以在生物膜（細胞和囊泡）的兩個方向上移動底物，抵抗其電化學梯度。研究結(jié)果表明，高表達的miR-128-3p通過下調(diào)癌細胞中的MRP5表達來減少奧沙利鉑的輸出。此外，降低的奧沙利鉑流出可導(dǎo)致更高的組織分布和細胞內(nèi)藥物定位，從而形成最終破壞腫瘤細胞的破壞性DNA-鉑加合物。簡而言之，結(jié)果表明與親本細胞相比，在奧沙利鉑抗性細胞中miR-128-3p表達顯著下調(diào)。miR-128-3p的過表達可以通過減少與奧沙利鉑抗性相關(guān)的Bmi1和MRP5表達來重建抗性細胞的敏感性。在體外和體內(nèi)，奧沙利鉑聯(lián)合miR-128-3p過表達比單獨的奧沙利鉑更有效地抑制抗性CRC細胞的發(fā)展。

將外源性合成siRNA與miRNA進行對比是非常重要的，miRNA是正常細胞中的內(nèi)源性分子，具有可能較少的意外脫靶沉默效應(yīng)。由于microRNA分子靶向一組編碼基因而不是單一基因，因此基于microRNA干擾的治療可能通過靶向多種分子途徑在癌癥治療中更有效。外泌體具有保護細胞內(nèi)容的能力，如miRNA免于循環(huán)中的降解，并作為攜帶者將其供體細胞的內(nèi)容傳遞給受體細胞。雖然脂質(zhì)體也可能比基于病毒的遞送系統(tǒng)提供治療性分子遞送的優(yōu)勢，但它們表現(xiàn)出低效率和從循環(huán)中快速清除。與脂質(zhì)體不同，外泌體含有膜錨定和跨膜蛋白，可在功能上增強內(nèi)吞作用，從而促進其內(nèi)部物質(zhì)的傳遞。

外泌體蛋白，如CD47，可以逃避循環(huán)單核細胞的吞噬作用，并增加外循環(huán)中外泌體的半衰期。此外，最近的證據(jù)表明，與脂質(zhì)體相比，外泌體表現(xiàn)出更高的“藥物”傳遞能力并抑制腫瘤生長。此外，當在體內(nèi)使用合成納米粒子時，使用外泌體也可以最小化細胞毒性。同時，由于它們的納米尺寸，外泌體被作為用于探索開發(fā)新治療應(yīng)用的納米裝置。

本研究展示了一種通過128-exo介導(dǎo)的治療性miR-128-3p轉(zhuǎn)移來增加CRC化學敏感性的新策略。研究表明來自miR-128-3p過表達FHC的外泌體可以在體外和體內(nèi)將miR-128-3p遞送到耐奧沙利鉑的CRC細胞中，通過改變靶基因Bmi1和bmi1的表達進一步恢復(fù)CRC細胞對化學治療劑的敏感性。因此，通過降低靶基因的表達，來自miR-128-3p修飾的FHC的外泌體可以通過抑制EMT和藥物的外排有效地增加CRC細胞的化學敏感性。鑒于奧沙利鉑的全身治療是晚期CRC的標準治療，進一步測試了128-exo是否可以在小鼠模型中發(fā)揮其抑制功能。使用比臨床量更低濃度的奧沙利鉑來治療CRC異種移植腫瘤，免疫組織化學分析結(jié)果表明，128-exo的腫瘤內(nèi)注射通過降低Bmi1和MRP5的表達，在較低的奧沙利鉑濃度下顯著增強腫瘤抑制。另外，體外實驗表明128-exo處理隨著時間的推移減少了CRC細胞中的基因表達，直至128-exo處理。

本研究結(jié)果表明，miR-128-3p不僅可作為奧沙利鉑反應(yīng)的臨床生物標志物，還可作為治療靶點。通過外泌體遞送miR-128-3p增加了CRC細胞對奧沙利鉑的敏感性，從而為CRC提供了新的治療策略。

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