無論是克隆和表達(dá)、還是基因組編輯，質(zhì)粒都是我們必備的工具。常用的質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)室一般都有，或者隔壁實(shí)驗(yàn)室有，那就你有我有大家有。不過，對于基因組編輯這種新的應(yīng)用，手頭的質(zhì)?？隙ú缓线m。2015年有哪些熱門的質(zhì)粒技術(shù)出現(xiàn)？Addgene最近有統(tǒng)計(jì)。

分裂的Cas9系統(tǒng)

大家都知道，Cas9蛋白是由N端的DNA識別結(jié)構(gòu)域和C端的核酸酶結(jié)構(gòu)域組成的。張鋒的研究團(tuán)隊(duì)利用Cas9的這種特殊結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出一系列“分裂的”Cas9分子（split Cas9），它們不能單獨(dú)發(fā)揮作用，在二聚化后才能形成功能齊備的Cas9。

這種技術(shù)將野生型的Cas9分裂成N端（Cas9(N)-2xNLS）和C端（Cas9(C)-2xNLS）片段，以便實(shí)現(xiàn)共表達(dá)和自我組裝后的DNA靶點(diǎn)切割。為了對基因敲除或激活有更精確的時間控制，C端的cas9片段融合了FK 506結(jié)合蛋白12（Cas9(C)-FKBP-2xNLS），而N端融合了雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Cas9(N)-FRB-NES），實(shí)現(xiàn)了雷帕霉素誘導(dǎo)的基因組編輯。

在沒有雷帕霉素處理時，Cas9(N)-FRB-NES片段被運(yùn)出細(xì)胞核。在雷帕霉素處理后，Cas9(N)-FRB-NES和Cas9(C)-FKBP-2xNLS二聚化，流入細(xì)胞核，在那里形成有功能的Cas9分子。這個系統(tǒng)讓用戶能夠?qū)RISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組修飾和基因表達(dá)有更好的時間控制。

（Zetsche etal., Nat Biotechnol. 2015 Feb 2;33(2):139-42. doi: 10.1038/nbt.3149.）

光誘導(dǎo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)

光遺傳學(xué)是一種強(qiáng)大的工具，它利用光來控制和監(jiān)控單個活細(xì)胞，以了解它們?nèi)绾喂ぷ?。光活化讓科學(xué)家能夠從時間和空間上控制哪些基因開啟或關(guān)閉。此前，科學(xué)家已經(jīng)利用DNA引導(dǎo)的光遺傳學(xué)工具成功調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；不過，讓光活化的蛋白結(jié)構(gòu)域到達(dá)特定位置還是蠻困難的。

為了克服DNA引導(dǎo)系統(tǒng)（如TALEN或ZFN）的許多限制，Gersbach實(shí)驗(yàn)室修改了RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，開發(fā)出一種快速而靈活的工具。在這個系統(tǒng)中，Polstein和Gersbach融合了光誘導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)域CibN和Cry2，分別讓dCas9和VP64失活。CibN和Cry2形成異源二聚體，可用藍(lán)光活化。它們將VP64反式激活因子和dCas9定位到基因組的特定位點(diǎn)上，并激活轉(zhuǎn)錄。這種LACE技術(shù)有著許多潛在的應(yīng)用。

（Polstein LR& Gersbach CA, Nat Chem Biol 2015 Mar;11(3):198-200.）

明亮的SunTag系統(tǒng)

在蛋白成像的過程中，一般的思路是將蛋白質(zhì)與熒光蛋白（如GFP）融合。然而，在普通的熒光顯微鏡下，帶GFP結(jié)構(gòu)域的單個蛋白是很暗淡的，但添加太多GFP結(jié)構(gòu)域又會讓蛋白變得過大。于是，加州大學(xué)的研究人員開發(fā)出SunTag系統(tǒng)。

這個系統(tǒng)是一個合成的支架，最多能招募蛋白質(zhì)的24個拷貝。具體而言，在目的蛋白上融合多個同源的肽段表位，之后用融合sfGFP的scFv抗體對其進(jìn)行熒光標(biāo)記。這個系統(tǒng)放大了熒光信號的強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)單分子的追蹤，而不會影響蛋白質(zhì)的功能。與dCas9融合后，SunTag系統(tǒng)也能上調(diào)基因表達(dá)。研究人員曾試過將多個拷貝的VP64招募到sgRNA靶定的基因，提高了靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。

（Tanenbaumet al., Cell. 2014 Oct 8. pii: S0092-8674(14)01227-6.）

高效的克隆載體

新西蘭惠靈頓維多利亞大學(xué)的研究人員開發(fā)出一種自適應(yīng)的細(xì)菌表達(dá)載體，使克隆效率和基因表達(dá)接近100%。這種pUCXKT載體確保所有篩選的質(zhì)粒都含有一個基因變異，且適用于高通量和低通量的篩選應(yīng)用。這個系統(tǒng)能夠輕松修改，以使用不同的抗生素、限制性內(nèi)切酶和質(zhì)粒骨架。

pUCXKT載體含有一個截短版本的卡那霉素抗性基因，缺少了最前面的兩個密碼子。在截短基因和啟動子之間插入了兩個終止密碼子，以防止這種抗性的滲漏表達(dá)。與之前的系統(tǒng)不同，pUCXKT載體不會引起抗生素表達(dá)框與目的基因的融合翻譯。

在擴(kuò)增待表達(dá)的基因時，正向引物是基因特異的，含有所需的限制性酶切位點(diǎn)（MCS），而反向引物含有抗性基因缺少的密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、SacI限制性酶切位點(diǎn)以及一個接頭區(qū)。之后將PCR產(chǎn)物連接到pUCXKT的MCS/SacI位點(diǎn)上，去除終止密碼子，補(bǔ)上抗性基因缺少的密碼子。因此，pUCXKT重組克隆就具有卡那霉素和氨芐青霉素的抗性。

（Prosser etal., Biotechnol Lett. 2015. 37:383-389.）