【原】北京大學醫(yī)學部：是好是壞？內(nèi)源分泌的外泌體可以攜帶功能性gRNA和Cas9蛋白

hzangs 2020-11-06

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CRISPR/ Cas系統(tǒng)是一種有效的基因編輯工具，具有極大的臨床應用潛力，盡管存在著遞送、脫靶等問題仍需要解決。近日，來自北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院魯鳳民、王杰課題組的研究人員發(fā)現(xiàn)，表達CRISPR/Cas9的細胞可以分泌攜帶功能性gRNA和Cas9蛋白的外泌體，這些外泌體可以向其他組織細胞輸送基因編輯活性。外泌體的這一作用雖然可以避免病毒載體系統(tǒng)本身帶來的副作用，但由于外泌體的廣泛傳遞性也為這一系統(tǒng)的應用帶來了新的風險。這項研究發(fā)表于Small雜志上（IF 10.856）。

CRISPR/ Cas系統(tǒng)來自于細菌和古細菌的適應性免疫系統(tǒng)，通過在靶基因組基因座處誘導DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）實現(xiàn)基因組編輯的目的。II 型CRISPR/ Cas系統(tǒng)是最簡單的系統(tǒng)，由DNA核酸內(nèi)切酶Cas9、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）組成。在工程應用過程中，crRNA和tracrRNA融合成為單一的嵌合向導RNA（gRNA）。CRISPR /Cas9系統(tǒng)目前已被廣泛用于編輯人、動物、植物和微生物的基因組。

CRISPR/ Cas9系統(tǒng)具有臨床應用前景，但是缺乏安全有效的傳遞系統(tǒng)是一個問題。目前，CRISPR / Cas9系統(tǒng)通常是通過體內(nèi)病毒載體遞送，比如慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒（AAV）載體。然而，病毒載體的可能的細胞毒性、免疫原性和長期表達仍然是臨床應用的障礙。最近，一些非病毒傳遞方法正在開發(fā)中，如脂質(zhì)樣納米粒子、Cas9蛋白/gRNA核糖核蛋白復合物，但它們的穩(wěn)定性、安全性和效率有限。外泌體是一種納米級細胞外脂質(zhì)雙層囊泡，直徑30 -150nm，廣泛用于治療和診斷應用。例如，腫瘤來源的外泌體在體外通過電穿孔的方式包裝CRISPR / Cas9表達質(zhì)粒，用作CRISPR / Cas9系統(tǒng)的載體。此外，一種脂質(zhì)體雜交外泌體，所得到的雜合納米粒子可以有效地將大的CRISPR / Cas9表達質(zhì)粒包封并遞送到靶細胞中。然而，使用CRISPR /Cas9表達質(zhì)粒通常在靶細胞中對基因組DNA片段的整合出現(xiàn)非特異性編輯。為了更安全地使用CRISRPR / Cas9系統(tǒng)，一些研究報道了使用細胞外囊泡來遞送Cas9 /gRNA復合物。例如，通過將Cas9蛋白與ARRDC1連接形成ARRDC1介導的微泡（ARMMs），以及通過用水泡性口炎病毒（VSV-G）的糖蛋白修飾供體細胞形成的攜帶RNPs的囊泡（VEsiCas），通過這些手段可以模擬病毒感染過程。此外，脫靶效應對CRISPR /Cas9系統(tǒng)的臨床應用提出了另一個主要挑戰(zhàn)。幸運的是，高保真Cas9（SpCas9-HF1）、增強特異性Cas9（eSpCas9（1.1））和超精確Cas9（HypaCas9）蛋白突變體可以顯著減少的脫靶切割。所以用于臨床實踐的CRISPR /Cas9系統(tǒng)還需要更多的努力。

HepAD38細胞是一種常用的乙型肝炎病毒（HBV）穩(wěn)定復制細胞模型。在這個細胞中，通過轉染HBV特異性gRNA引導的CRISPR/ Cas9表達質(zhì)?？梢砸种贫噙_30％的HBV復制，即使CRISPR / Cas9轉染效率僅為10％左右。外泌體可以傳遞microRNA / lncRNA和細胞蛋白用于細胞間通訊，因此研究人員認為，從HBV特異性CRISPR / Cas9表達質(zhì)粒轉染的細胞分泌的這種細胞外載體（EV）也能夠提供CRISPR / Cas9系統(tǒng)，從而向周圍的HepAD38細胞擴散這種基因編輯活性。因此，本研究旨在探索天然產(chǎn)生的內(nèi)源外泌體攜帶和提供CRISPR / Cas9系統(tǒng)進行基因編輯的能力。

在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)表達CRISPR / Cas9的細胞可以分泌內(nèi)源外泌體，而gRNA和Cas9蛋白存在于這些外泌體中并從細胞中釋放。進一步的實驗證明，這些天然產(chǎn)生的內(nèi)源性外泌體可用作載體，以遞送功能性Cas9和乙型肝炎病毒（HBV）特異性gRNA，切割在HBV感染的HuH7細胞中的HBV DNA，或者利用人乳頭瘤病毒（HPV）特異性gRNA中切割HeLa細胞中的HPV DNA。該研究證明了內(nèi)源外泌體作為功能性gRNA和Cas9蛋白的安全有效遞送載體的潛力。但是，內(nèi)源外泌體介導的基因編輯活性向鄰近和遠端細胞或組織的遞送，可能會進一步使CRISPR / Cas9系統(tǒng)的脫靶和安全性問題復雜化。

參考文獻：Chen R, Huang H, Liu H, Xi J, Ning J, Zeng W, Shen C, Zhang T, Yu G,Xu Q, Chen X, Wang J, Lu F. Friend or Foe? Evidence Indicates Endogenous Exosomes Can Deliver Functional gRNA and Cas9 Protein. Small. 2019 Jul4:e1902686.