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ReproRNA?-OKSGM為單鏈RNA復制子、非整合型的重編程載體。該載體包含一個嘌呤霉素抗性基因片段，用于篩選出含此載體的細胞。因此，沒有含此載體的細胞會被嘌呤霉素去除。在轉(zhuǎn)染后的第1到6天進行篩選，可去除培養(yǎng)中未被轉(zhuǎn)染的成纖維細胞。STEMCELL Technologies推薦的篩選過程中嘌呤霉素的使用濃度為0.8 μg/mL。該濃度既保證嘌呤霉素的毒性足夠去除未被轉(zhuǎn)染的成纖維細胞以降低背景，又不會過量而對轉(zhuǎn)染過的細胞具有毒性，導致重編程效率降低。對于一些特定的細胞系，如果在篩選步驟后發(fā)現(xiàn)剩余細胞或者被去除的細胞過少，說明0.8 μg/mL嘌呤霉素并不是一個合適的濃度。在此情況下，可按照以下步驟做一個細胞毒性檢測來決定適當?shù)臐舛取?/span> 操作流程 1. 成纖維細胞以5 x 10^4 cells/mL的濃度接種于96孔板，并使用成纖維細胞培養(yǎng)基在 37°C，5%CO2條件下孵育過夜，使細胞貼壁。 成纖維細胞培養(yǎng)基: 高糖DMEM； 10% (v/v) FBS（胎牛血清）； 2. 第二天，制備含不同濃度嘌呤霉素的成纖維細胞培養(yǎng)基。請參見下面表格中的示例，您可根據(jù)需要來選取不同嘌呤霉素濃度或樣本重復數(shù)。例如，選取嘌呤霉素濃度為1.2，1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1和0 μg/mL。 3. 在顯微鏡下觀察96孔板，確認成纖維細胞已貼壁。通常情況下，細胞密度大約為80%。 4. 將原培養(yǎng)基換成含不同濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基，在37°C，5%CO2下培養(yǎng)過夜。 5. 在之后的5天內(nèi)每天重復步驟2-4。請注意：需當天制備新鮮的含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，我們不建議一次制備所需的全部培養(yǎng)基。 6. 在第5天，使用細胞活性檢測（如MTT或LDH）得到能夠去除80-100%的細胞的最小嘌呤霉素濃度。使用此濃度進行后續(xù)的ReproRNA?-OKSGM實驗的篩選步驟。 示例：在96孔板中每個樣本進行三次重復實驗 答疑時間 Q：ReproRNA?工作流程是否是feeder-free和serum-free？ A：整個工作流程是feeder-free的，但在成纖維細胞培養(yǎng)期間我們建議使用10%的FBS。 Q：如果不小心將轉(zhuǎn)染試劑和添加物放入了冰箱怎么辦？ A：雖然轉(zhuǎn)染試劑和添加物不應被冷藏保存，但可能依舊可以使用。您需要將試劑在室溫解凍并觀察是否有沉淀物出現(xiàn)，若有沉淀物出現(xiàn)應在室溫繼續(xù)解凍10-15分鐘（期間可進行vortex確保沉淀物重新溶解）。一旦沉淀物溶解后，試劑和添加物即可使用。 Q：載體在細胞中會保留多久？ A：在B18R的作用下，載體會存在于細胞中。B18R可下調(diào)細胞對外源性RNA的先天反應。RNA中的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼使得RNA可在陽性轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)復制。在嘌呤霉素的選擇壓力下，未能成功轉(zhuǎn)染ReproRNA?的細胞無法存活。我們并未檢測過誘導結(jié)束后ReproRNA?的殘留情況。Yoshioka的文章檢測了在去除嘌呤霉素和B18R蛋白后細胞內(nèi)RNA的表達情況。他們觀察到RNA在第8代（大部分在第5代）已全部被清除干凈。另外，他們并未檢測在細胞系中觀測到任何的整合情況，提示使用本系統(tǒng)進行wild-type iPSC建立的安全性。而仙臺病毒被證實在11代以后依舊存在于細胞中。 Q：重編程結(jié)束后，如何進行下游的分化？ A：使用ReproRNA?進行重編程的iPS細胞可成功的進行定型內(nèi)胚層、外胚層和中胚層祖細胞的分化，具體的操作流程和推薦可點擊這里申請我們的產(chǎn)品手冊！ 操作視頻
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