張珂凡    綜述   曲秀霞    范國平    審校

214122無錫，江南大學無錫醫(yī)學院（張珂凡、曲秀霞）；90095美國洛杉磯，加州大學戴維格芬醫(yī)學院人類遺傳學系（范國平）

通信作者：范國平，Email: gfan@mednet.ucla.edu

DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2018.11.011

【摘要】  眼是人類的重要器官，而視網(wǎng)膜退行性疾病可致盲，給患者帶來極大的痛苦。在目前的條件下，細胞移植是治療退行性眼病的重要方法之一。由于成體干細胞數(shù)量稀少，因此激活內(nèi)源性成體干細胞來治療退行性眼病還很困難，利用多能干細胞，包括胚胎干細胞（ESCs）以及誘導性多能干細胞（iPSCs）分化得到的光感受器細胞和視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞便成為有效的移植細胞來源。本文介紹視網(wǎng)膜退行性疾病中危害較大的視網(wǎng)膜色素變性（RP）和年齡相關性視網(wǎng)膜黃斑變性（AMD）的病理過程以及干細胞移植治療退行性眼病的發(fā)展現(xiàn)狀，對退行性眼病中2種不同的易損細胞，即RPE細胞和光感受器細胞干細胞療法研究現(xiàn)狀進行綜述，并對干細胞移植治療退行性眼病現(xiàn)階段存在的問題和未來的發(fā)展方向進行了探討。

【關鍵詞】年齡相關性黃斑變性；視網(wǎng)膜色素變性；誘導性多能干細胞；視網(wǎng)膜色素上皮；光感受器；細胞移植治療

視網(wǎng)膜退行性疾病主要包括視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）、黃斑變性以及遺傳性Leber病等，這些疾病存在著不同的癥狀以及相關致病基因或易感基因（表1）。盡管這些疾病的病因和病理進程各不相同，但都存在視網(wǎng)膜細胞數(shù)量的進行性減少，主要包括視網(wǎng)膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium，RPE）和光感受器細胞的不可逆損失，并最終導致視覺功能喪失。RP為遺傳性疾病，目前已發(fā)現(xiàn)200多個與RP相關的基因突變位點^[1]。黃斑變性是由基因改變和環(huán)境因素共同引起，根據(jù)患病年齡分為少年黃斑變性和年齡相關性黃斑變性（age related-macular degeneration，AMD)^[2]。臨床上RP和AMD較為普遍，其中RP的發(fā)病率高達1/3 000；而AMD在大于60歲的人群中的發(fā)病率超過1/10^[3-4]。目前，臨床上用來治療視網(wǎng)膜退行性疾病的藥物和方法非常有限，多數(shù)為抗炎治療及神經(jīng)細胞營養(yǎng)保護性藥物用以延緩病程，或者抑制血管生長類藥物以治療濕性AMD等。但是藥物治療無法恢復已經(jīng)受損的視神經(jīng)細胞和功能RPE細胞，而利用細胞移植手段則可以有針對性地將有特定功能的細胞移植并整合到視網(wǎng)膜中以恢復其受損功能，應用前景更為廣泛。因此本文著重介紹了RP以及AMD的病理過程以及細胞移植治療現(xiàn)狀。

1.1 RP的病理過程以及影響因子

綜合征性RP伴隨其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病或者發(fā)育異常出現(xiàn)，而非綜合征性RP則是單獨出現(xiàn)^[5]。RP早期會出現(xiàn)夜視能力下降以及中周部視野的缺失，負責感受弱光的視桿細胞的死亡，是非綜合征性RP產(chǎn)生的第一步。RP患者外周視野和視力會迅速下降，雙眼視力同時受損，最終會影響到中央視野、視敏度和彩色視覺。

遺傳性的RP包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X染色體連鎖遺傳等，目前已知許多基因的突變會導致RP。自從1989年首例視紫紅質(zhì)（rhodopsin，RHO）基因突變被首次發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)確定了超過100個RHO基因突變位點。這些位點的突變占所有RP類型的15%，而占常染色體顯性遺傳RP的25%^[6-7]。PRPF3、PRPF8、PRPF31和PAP1 4個pre-mRNA剪接相關因子的突變也會導致常染色體顯性遺傳RP。這些因子的表達十分廣泛，但是僅在視網(wǎng)膜中導致疾病，可能是因為視網(wǎng)膜的光感受器細胞需要更多的蛋白質(zhì)代謝參與^[8]。目前已知至少45個基因與常染色體隱性遺傳RP相關^[6]，例如USH2A基因突變被發(fā)現(xiàn)會導致10%~15%伴隨遺傳性耳聾－色素性視網(wǎng)膜炎綜合征（Usher Syndrome）^[9-10]。目前發(fā)現(xiàn)X染色體連鎖遺傳RP與RPGR和RP2等6個基因相關^[11-12]。

1.2 AMD的病理過程以及影響因子

AMD從病理上分為干性AMD和濕性AMD。干性AMD是由脈絡膜和RPE萎縮、脈絡膜增厚和黃斑萎縮引起的；濕性AMD是Bruch膜受損，脈絡膜的毛細血管在Bruch處形成新生血管，引起視網(wǎng)膜下黃斑區(qū)反復滲液和出血并形成瘢痕，繼而造成中心視覺喪失。正常RPE會在光感受器細胞和脈絡膜之間形成緊密連接的單層細胞片層^[13]，而光感受器細胞會不斷老化并產(chǎn)生廢棄物堆積在黃斑形成脈絡膜玻璃膜疣，并引發(fā)慢性炎癥^[14]。玻璃膜疣能夠進一步破壞RPE，致使光感受器細胞因得不到及時維護而受損，最終形成AMD（圖1）。

圖1  正常和退化的RPE細胞示意圖  A：正常RPE細胞整齊地排列于視神經(jīng)節(jié)和Bruch膜之間  B：退化的RPE細胞之間緊密連接缺失，視神經(jīng)節(jié)退化并伴有玻璃膜疣的產(chǎn)生    RPE：視網(wǎng)膜色素上皮

年齡是AMD的危險因子之一，老齡化會通過表觀遺傳學修飾，如DNA的甲基化以及組蛋白乙?；却龠M基因的沉默，通常在大于60歲的人群中會出現(xiàn)細胞功能損傷并有致病風險^[15]。線粒體是氧自由基反應的重要場所，線粒體基因的多態(tài)性，例如MT-ND2的多態(tài)性，與濕性AMD有關^[16]。VEGF與濕性AMD中的血管生成有關，因此其抑制劑被臨床用于治療濕性AMD^[17-18]。此外，受損的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)尤其是補體系統(tǒng)可能對AMD的病程有影響^[19]。一些補體的過度激活，會導致慢性炎癥的發(fā)生^[20]。由于免疫反應是導致AMD的重要因素，因此許多參與免疫反應的基因突變都是該疾病的重要風險因子，例如抑制炎癥反應的補體因子H （complement factor H, CFH）的Tyr402His突變會導致AMD的產(chǎn)生^[21]。目前已有一些與補體有關的治療AMD的藥物正在研究中，但是還沒有被批準用于臨床^[22]。

近些年，隨著干細胞技術(shù)的快速發(fā)展和細胞工程在臨床上的應用，細胞治療已經(jīng)逐漸成為一項應用前景廣、治療特異性好且安全、高效的、新的治療手段。眼科疾病的細胞治療由于存在所需細胞數(shù)量較低、移植技術(shù)成熟、存在免疫隔離等諸多優(yōu)勢，臨床前及臨床研究的開展更加充分。目前有望用于治療退行性眼病的干細胞有多種類型^[23]，例如間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、視網(wǎng)膜前體細胞（retinal progenitor cells，RPCs）、神經(jīng)前體細胞（neural progenitor cells，NPCs）、嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）、胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESCs）以及誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）等^[24-28]。MSCs有多種來源，包括骨髓來源、脂肪組織來源以及胎盤和臍帶血來源，具有自我更新的能力并可以分化成為多種細胞類型，但缺點是MSCs來源的光感受器細胞存活率和遷移效率都很低。RPCs來源于胎兒或新生兒視網(wǎng)膜，在移植過程中可以遷移進入視網(wǎng)膜中，發(fā)育為多種細胞類型的視網(wǎng)膜細胞并具有一定功能，但是存在細胞來源的局限，且具有潛在免疫排斥反應^[29]。NPCs來源于新生皮層，將其移植到光感受器細胞損傷的大鼠模型中能夠長期維持視覺功能^[30]，并且也已開展了臨床試驗。OECs是一類可以持續(xù)生長的膠質(zhì)細胞，移植后可以清除堆積在視網(wǎng)膜下腔中的碎片，為細胞生長提供營養(yǎng)因子并降低Müller細胞的損傷反應^[31]，但是移植細胞較難獲得且難以直接應用。ESCs是來源于囊胚的內(nèi)細胞團的具有多分化潛能的細胞，可以在分化為RPE以及光感受器細胞后用于移植^[32]；iPSCs是由體外終末分化的體細胞重編程而來的，具有與ESC類似的分化潛能，將RP患者來源的iPSCs分化為視網(wǎng)膜前體細胞后移植可以得到具有功能的RPE和光感受器細胞^[33-34]。美國FDA已批準多種細胞類型用于臨床治療退行性眼病的I/II期臨床試驗（表2）^[23]。

視網(wǎng)膜退行性疾病最終受累的細胞是RPE和光感受器細胞。目前，RPE已經(jīng)批準用于臨床治療研究，大量獲得可供移植的RPE和光感受器細胞不僅對于視覺改善有極大的作用，而且可以降低未分化的干/祖細胞的致瘤風險。通過ESCs以及iPSCs體外定向誘導分化可以獲得大量可供移植的細胞來源，因此下文將著重介紹RPE和光感受器細胞的臨床治療研究現(xiàn)狀。

2.1針對退行性眼病中RPE細胞的干細胞療法及其研究現(xiàn)狀

由于RPE有保護和支持光感受器細胞的作用，并且在退行性眼病中較早受累，因此RPE移植是目前治療退行性眼病的重要臨床方案之一，人ESCs以及iPSCs來源的RPE細胞移植治療都已開展了臨床試驗^[27-28]。細胞移植的方法主要有2種：一種是注射懸浮的細胞；另一種是移植帶膜或不帶膜支撐的RPE單層細胞。實驗研究表明，在免疫缺陷小鼠中進行RPE細胞長期移植不會產(chǎn)生腫瘤^[28]。在免疫缺陷的大鼠視網(wǎng)膜下腔移植的人ESCs來源RPE單層細胞存活時間超過12個月且無腫瘤形成^[35]。首例ESCs來源的細胞治療在人體的臨床療效試驗中，也沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤的跡象^[36]；對18例接受細胞治療患者的跟蹤研究也未發(fā)現(xiàn)嚴重的安全問題^[28,37]。同樣，iPSCs來源的RPE細胞層的移植也未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成免疫排斥^[27]。此外，Choudhary等^[38]開發(fā)的基于CD59的流式分選方案能有效凈化干細胞來源的RPE并去除殘余干細胞，進一步增加了細胞替代療法的安全性。美國FDA已經(jīng)批準ESCs分化得到的RPE治療黃斑變性的臨床試驗^[23,36]。在此研究的基礎上，韓國也開展了ESCs分化得到的RPE治療AMD的臨床試驗^[39]。

在細胞替代療法中，安全、高效的細胞來源異常重要。McGill等^[40]報道了將異種級人胚胎干細胞（OpRegen）衍生的RPE移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下。OpRegen RPE細胞不僅能存活和改善視覺功能，還能長期保護視錐和視桿細胞。此外，患者自身來源的iPS細胞分化后移植可以降低免疫排斥和異體細胞導致的基因多樣性的風險，有望用于基因治療。2013年，1例日本女性AMD患者接受了全球首例自體來源的RPE移植^[41]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，細胞和仿Bruch膜的共同移植以及三維的人胚胎干細胞來源的RPE（3D-RPE）也逐漸進入人們的視野，為細胞療法治療退行性眼病提供了新的治療思路和細胞來源^[42]。

綜上所述，在針對退行性眼病中RPE細胞的干細胞療法的臨床治療中，安全性問題仍是關注的第一熱點。關于如何使移植的干細胞不形成腫瘤和發(fā)生免疫排斥，近年來取得了較大進展，細胞替代療法的安全性日益提高。此外，細胞來源將成為未來干細胞療法的關注焦點，目前人ESCs、iPSCs和自身來源的細胞都在干細胞治療中表現(xiàn)出巨大的潛力?？傊?，針對退行性眼病中RPE細胞的干細胞療法正在不斷完善，其在臨床上的應用也日益廣泛和安全。

2.2針對退行性眼病中光感受器細胞的干細胞療法的治療和研究現(xiàn)狀

退行性眼病，如RP和AMD會導致光感受器細胞損失，繼而造成視力障礙。因此，RPE移植需要在光感受器細胞受損早期尚能可逆修復時進行，或者移植進入的RPE細胞含有可分化成為光感受器細胞的前體細胞時，才能更好地恢復視覺功能。有研究表明，基于ESCs或iPSCs的細胞替代療法和CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)可以作為研究和治療RP的新手段^[43-44]。更有團隊提出了一種將人骨髓MSCs與人RPCs進行聯(lián)合移植治療RP的方案，在RCS大鼠模型中的實驗表明聯(lián)合移植的光感受器細胞的分化率高于單一移植^[45]。與治療RP的思路相同，基于ESCs或iPSCs的細胞療法在治療AMD上也具有巨大潛力^[46-47]。在近幾年中，不同團隊分別研究了小鼠ESCs來源的可追蹤和可移植的光感受器細胞的生成和人ESCs來源的視網(wǎng)膜組織在2種視網(wǎng)膜退化的靈長類模型中移植的可行性^[48-49]。又有研究表明，將發(fā)育中的視桿細胞移植入Crx基因敲除小鼠的退化視網(wǎng)膜中時，其表現(xiàn)出的神經(jīng)活動與原生的光感受器細胞類似^[50]。因此，體外iPSCs來源的視桿細胞可以為細胞替代療法提供一個新的細胞來源。此外，Barnea-Cramer等^[51]將人iPSCs來源的光感受器細胞前體移植入視網(wǎng)膜變性晚期的小鼠中，并成功分化為光感受器細胞且與宿主細胞的視神經(jīng)相連，通過視覺行為實驗發(fā)現(xiàn)被治療的動物的視覺功能得到了部分恢復，且功能改善程度與移植細胞的數(shù)量呈正相關。由此可見利用ESCs或者iPSCs分化成的光感受器細胞進行移植可以更為直接地達到恢復視力的目的。

為了使移植后的干細胞能有效分化為具有功能的光感受器細胞，干細胞的來源十分重要。Kruczek等^[52]發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細胞來源的視錐細胞在終末期視網(wǎng)膜變性小鼠模型中表現(xiàn)出了很好的生產(chǎn)和成熟能力。Royall等^[53]也提出了一種新的培養(yǎng)方案可以將豬虹膜組織中一獨特的神經(jīng)干/祖細胞分化為神經(jīng)元和視桿樣細胞。鑒于人類與家豬在進化上的相似性，這一方法在人類疾病建模和人眼干細胞的研究中具有重要價值。研究表明，RPE細胞是一個能生成新光感受器細胞的便捷來源^[55-55]。此外，來源于患者自體細胞的iPSCs在干細胞治療中也有很大的潛力。Wiley等^[56]在cGMP（current good manufacture practices）條件下發(fā)展出了一種用來源于患者皮膚細胞的iPSCs制造光感受器細胞前體的臨床適用性方法，并且沒有發(fā)現(xiàn)異常增生和腫瘤的形成。但是患者來源的iPSCs仍然攜帶有致病基因，因此有團隊對此展開研究，發(fā)現(xiàn)可以利用CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)來糾正來自患者iPSCs的致病突變^[57]。這極大地提高了來源于患者自體細胞的干細胞療法的臨床適用性。

總體來說，退行性眼病中光感受器細胞的干細胞療法關鍵在于在患者體內(nèi)移植干細胞能成功分化為具有功能的光感受器細胞。在這一方面，雖然在動物實驗中取得了較多成果，但是在未來仍需要更多的臨床驗證結(jié)果；同時我們?nèi)孕枰綄つ芨行У胤只癁榫哂泄δ艿墓飧惺芷骷毎母杉毎麃碓?，并增強其臨床適用性。

眾多動物實驗及部分臨床試驗證明干細胞移植對退行性眼病治療具有巨大潛力，但由于不同干細胞本身存在基因組或者表觀遺傳學改變，例如基因突變、基因拷貝數(shù)改變以及重編程過程中DNA甲基化水平的異常改變等^[58]，均可能導致對干細胞的分化及分化后細胞功能和行為產(chǎn)生背景性影響，導致不同細胞系來源的視網(wǎng)膜細胞本身就可能存在差異性，因此干細胞來源的視網(wǎng)膜細胞移植的遠期有效性和安全性依然有待進一步深入評估^[59]。除了本文提到的干細胞來源的視網(wǎng)膜細胞移植，神經(jīng)干細胞移植、MSCs移植等其他類型的細胞移植臨床試驗也在開展中，而異體細胞移植的首要問題，即移植免疫排斥反應仍是細胞治療的巨大挑戰(zhàn)。為了解決上述問題，Nakatsuji等^[60]嘗試建立多能性細胞庫用以匹配人白細胞抗原，以此減少免疫反應。另外，異體移植帶來的基因組改變?nèi)匀皇且粋€潛在的問題，因為其中的自體細胞重編程技術(shù)中仍無法精細控制，需要進一步研究。2016年，來自中國中山大學、四川大學、廣州市康瑞生物科技有限公司和美國加州大學圣地亞哥分校、德州大學西南醫(yī)學中心、哈佛大學醫(yī)學院的研究人員開發(fā)出一種新的再生醫(yī)學方法，通過改良的白內(nèi)障手術(shù)技術(shù)，在移除先天性白內(nèi)障嬰兒晶狀體的同時，保留并刺激自身晶狀體干細胞成功再生出功能性的晶狀體。該方法通過激活患者自身的內(nèi)源性干細胞進行組織再生修復，相較于通過ESCs/iPSCs體外分化出功能細胞或組織再移植到患者體內(nèi)，再生組織的結(jié)構(gòu)和功能更完善，且有效避免了免疫排斥和體外多重誘導帶來的潛在變異問題^[61]。雖然有局限性，視網(wǎng)膜細胞的移植治療依然給退行性眼病的治療帶來了希望，并且隨著實驗技術(shù)的不斷優(yōu)化，利用ESCs更高效地分化為各種類型的視網(wǎng)膜功能細胞也將會為退行性眼病的治療提供更多的細胞來源。此外，現(xiàn)今發(fā)展的CRISPR技術(shù)可以高效特異地修復突變基因，對于退行性眼病的個性化治療也將產(chǎn)生十分積極的作用^[62-65]。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的技術(shù)可以用于退行性眼病的治療，并且也會更為安全、有效。