作為分子實(shí)驗(yàn)狗，我相信，每一個(gè)做過分子克隆的人，都有過對(duì)條帶、菌落和測序結(jié)果望穿秋水的時(shí)刻，畢竟有些時(shí)候克隆實(shí)驗(yàn)是限速步驟。在這個(gè)過程中，人品是很重要滴，但是乜，大家也應(yīng)該隨時(shí)隨地對(duì)克隆保持警惕，一旦出現(xiàn)問題立刻進(jìn)行反思、改正。如果重復(fù)幾次還沒看到你心心念念夢寐以求的結(jié)果，請(qǐng)一定記得回頭，仔細(xì)核查實(shí)驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，不要懷揣著僥幸心理哦！

OK，下面讓我們一起，把上次未填完的坑繼續(xù)填平吧！

1.      載體沒有處理好。如果載體通過PCR擴(kuò)增得到，擴(kuò)增產(chǎn)物可能殘留大量環(huán)狀質(zhì)粒模板，可選擇膠回收純化，降低污染。如果載體通過酶切得到，可能殘留大量未切開質(zhì)粒，增加酶量、延長酶切時(shí)間和酶切后切膠回收，都可以有效減少甚至消除環(huán)狀質(zhì)粒的殘留；

2.      反應(yīng)體系被具有相同抗性的質(zhì)粒or雜菌污染。

1.      首先，確保測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般來說，測序結(jié)果的頭尾兩端可信程度較低，存在一定的錯(cuò)誤率，中間600~800bp的片段可靠性較高，如果心存疑慮可以換一家公司重新檢測；

2.      擴(kuò)增目的片段時(shí)確保引物設(shè)計(jì)無誤；

3.      確保擴(kuò)增后目的片段大小正確，且為單一條帶。如果出現(xiàn)非特異性條帶，建議優(yōu)化PCR體系提高特異性，重新擴(kuò)增后膠回收純化，得到正確的目的片段；

4.      目的片段切膠回收時(shí)，在紫外燈下不能暴露過長時(shí)間，UV照射會(huì)引起較高的突變率；

5.      如果線性化載體不是由空載體酶切或擴(kuò)增制備，而是由已插入其他不同片段的載體酶切或擴(kuò)增制備得到的話，不完全酶切或殘留環(huán)狀模板質(zhì)粒將導(dǎo)致很高的轉(zhuǎn)化背景，使部分克隆中含有不正確插入片段。提高酶切效率、使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，都可以有效避免此類情況發(fā)生；

6.      插入的目的片段序列過大時(shí)，建議選擇轉(zhuǎn)化效率較高的感受態(tài)細(xì)胞。前一篇我們說過了，有些時(shí)候可能你的克隆已經(jīng)連接成功，然而一旦選擇了活性差的感受態(tài)細(xì)胞，則很有可能功虧一簣（再度安利我們的高效感受態(tài)，性價(jià)比高，物美價(jià)廉，活力都是杠杠的）。

7.      最后的最后，如果上述都救不了你的克隆的時(shí)候，只能采取最最最最最原始的方法：鑒定更多的菌落。也就是說，多挑幾（十）個(gè)菌落，多做幾（十）次PCR鑒定，然后送去測序。有些克隆本身連接的成功率較低，長出的菌落數(shù)目也較少，在這種情況下，只能通過挨個(gè)菌落PCR鑒定來找到對(duì)的克隆。

上述這種情況，不知大家是否遇到過？小編倒是遭遇過幾次，總是懷疑測序公司有誤，然鵝換一家測序，結(jié)果還是一樣的，一臉懵逼.jpg。

那么這種情況是咋么產(chǎn)生的乜？菌落PCR的假陽性高，關(guān)鍵在于做連接的時(shí)候加了較多目的基因的酶切產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化時(shí)，未連接上的目的片段，有的會(huì)沾在感受態(tài)細(xì)胞上，有的在溶液中，涂板時(shí)一起涂在板上了，挑菌的時(shí)候把平板上沒轉(zhuǎn)進(jìn)去的片段也挑到了，當(dāng)然，沒有轉(zhuǎn)進(jìn)菌的載體也在平板上。所以，我們PCR擴(kuò)增出的假陽性率，其實(shí)是很高的，PCR只是一個(gè)初步的篩選。

So，我們應(yīng)該怎么辦呢？

1.      可挑菌落溶在10或者20 ul水中，新平板上劃線，觀察生長情況，如果生長則進(jìn)行鑒定，陽性送去測序；

2.      用載體引物和目的片段引物一起擴(kuò)增，不能只用目的片段/載體引物。即，用一個(gè)載體上的引物（如通用引物T7等），再用一個(gè)目的片段上的引物進(jìn)行擴(kuò)增；

3.      挑菌落搖小管，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，當(dāng)然，雙酶切驗(yàn)證更為可靠。酶切后電泳，應(yīng)把重組質(zhì)粒同酶切的產(chǎn)物一起點(diǎn)樣，如果重組質(zhì)粒的大小等于酶切后兩條帶的大小，說明重組成功；

4.       此外，也可以多做幾個(gè)雙酶切或三酶切，每組中至少有一個(gè)酶是插入片段上的，電泳跑膠，從而確保目的片段插入到載體中。

話說分子實(shí)驗(yàn)，本來就很tricky的！所以啊，小伙伴們，還有很長滴路要走滴，還有很多滴淚要慢慢流滴，還有無數(shù)次失敗滴實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓你堅(jiān)信當(dāng)年選了這一行是腦子進(jìn)了水滴，anyway，分子克隆的一系列坑今天暫時(shí)填平了，希望小伙伴們的科研生活就像今天的封面DNA圖一樣，七彩斑斕，色彩繽紛（我在胡說些什么？實(shí)驗(yàn)室怎么可能會(huì)有這樣的生活？除非是大腸桿菌入腦了。。。。）OK，下次，我們?cè)僖娎玻(*≧▽≦*)n