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實驗流程:1)查找相關基因啟動子區(qū)域 2)預測啟動子可能的結合位點(如果需要進行截斷載體構建)3)設計啟動子引物(特別重要,一對好的引物能讓你快速的擴增出你需要的DNA片段,如果引物不好,無法擴增出目的片段,后面操作無從談起)4)選擇合適的載體(我常用的是PGL3-basic、Pmir-GLO等)5)選擇合適的限制性酶切位點并加入引物5端,然后合成引物(查看載體圖譜,查看多克隆位點區(qū),MCS。并結合擴增序列的酶切位點找到最適合的酶切位點)6)PCR擴增目的DNA片段 7)載體和DNA片段雙酶切,并按比例連接,轉化,鑒定,質粒提取,最后酶切鑒定8)測序 9)測序正確后,質粒轉染細胞,然后進行熒光檢測。 PS:載體構建一般片段長度越長越難弄,你的2100bp還行,不算難。但對你一個初學者來說也算是挑戰(zhàn)了,所以建議交由專門的生物公司做,當然如果你時間允許也可以自己動手。 一般的DNA聚合酶是只能擴增幾百bp,因為目的片段較長而且可能出現(xiàn)大量的堿基錯配或者堿基丟失等情況,所以推薦使用高保真酶進行PCR擴增,既能擴增大片段,也能保證擴增產(chǎn)物的完整性。 一般PCR擴增的試劑、酶切試劑、連接等一系列試劑都需要單獨購買。后面熒光檢測的試劑也需要單獨購買。 就那么多吧,也不是很詳細,畢竟質粒重組程序很多,很多細節(jié)也很重要,沒法一一寫來。 |
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