1：linker組蛋白H1.2能夠抑制ATM依賴(lài)的DNA損傷

首先研究者利用CRISPR-Cas9分別構(gòu)建H1.2、H1.3、H1.4敲除細(xì)胞系(Fig.1a)，發(fā)現(xiàn)只有H1.2敲除細(xì)胞中etoposide和IR激活的H2AX, NBS1, SMC1和ATM等marker水平上升（Fig.1b-c）。單純的過(guò)表達(dá)H1.2并不會(huì)影響DNA損傷中γ-H2AX水平（Fig.1d）。接下來(lái)研究者分別使用兩個(gè)DSB誘導(dǎo)的激酶抑制劑：

1）  ATM：Ku55933

2）  DNA-PK：Ku57788

發(fā)現(xiàn)只有Ku57788能夠抑制能夠抑制DNA損傷中γ-H2AX水平（Fig.1d），另外siATM能夠回復(fù)H1.2缺失導(dǎo)致的下游（SMC等）磷酸化激活，但DNA-PK和ATR則無(wú)此作用（Fig.1e）,說(shuō)明可能H1.2的功能可能通過(guò)ATM執(zhí)行，而不是DNA-PK。并且在ATM缺失的A-T cells中H1.2缺失則對(duì)γ-H2AX水平?jīng)]有影響（Fig.1f）。Figure 1g和h說(shuō)明，H1.2缺失會(huì)導(dǎo)致ATM水平的上升，暗示了H1.2對(duì)ATM功能的負(fù)向作用。

Figure 1

2：H1.2能夠直接結(jié)合ATM，并抑制其酶活

ATM能夠催化p53的磷酸化，H1.2的表達(dá)則會(huì)抑制p53磷酸化水平、H2AX的磷酸化（Fig.2a），說(shuō)明H1.2能夠抑制ATM活性（Fig.2b）。體外pull-down、和質(zhì)譜都證明H1.2通過(guò)c末端結(jié)合ATM的HEAT重復(fù)結(jié)構(gòu)域（Fig.2c-f），并且結(jié)合會(huì)抑制ATM的功能（Fig.2e）。etoposide誘導(dǎo)DNA損傷后，ATM和H1.2的結(jié)合減弱（Fig.2h）。

Figure 2

3：H1.2能夠結(jié)合MRN復(fù)合體，影響ATM的招募和激活

DNA損傷后，ATM損傷過(guò)程需要MRN復(fù)合體（包括MRE11、RAD50、和NBS1）。研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)H1.2能夠結(jié)合MRN復(fù)合體（Fig.3b），主要是結(jié)合MRE11而不是RAD50和NBS1(Fig.3b-d)。NBS1缺失影響ATM活性，而進(jìn)一步敲低H1.2又會(huì)回復(fù)部分活性（Fig.3e-f）。同樣的，全長(zhǎng)的H1.2過(guò)表達(dá)會(huì)抑制ATM與MRN復(fù)合體的結(jié)合，而c末端缺失的則不起作用（Fig.3g-h），而且可以進(jìn)一步抑制DNA損傷后ATM和復(fù)合體的結(jié)合增強(qiáng)（Fig.3i），以上結(jié)果都證明H1.2能夠通過(guò)直接結(jié)合調(diào)控ATM和MRN復(fù)合體之間的結(jié)合。

Figure 3

4：DNA損傷過(guò)程中H1.2迅速解離并降解

研究者發(fā)現(xiàn)，DNA損傷刺激后，H1.2水平會(huì)逐漸降低(Fig.4a-e)；并且蛋白酶體抑制劑MG132、 Oprozomib能夠抑制這種降解（Fig.4f-g）。另外HDAC抑制劑TSA和NaB能夠促進(jìn)H1.2的降解（Fig.4h），NaCl同樣能夠促進(jìn)H1.2降解（Fig.4i）。

Figure 4

5: DNA損傷誘導(dǎo)PRAP催化H1.2的解離

研究者分別用ATM、DNA-PKs和PARP抑制劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PARP的抑制能夠降低H1.2的解離（Fig.5a）；并且PARP的敲除也會(huì)得到類(lèi)似的作用（Fig.5b-c）。PAR能夠與H1.2結(jié)合，但c末端缺失、以及S188A（預(yù)測(cè)的PAR修飾位點(diǎn)）突變的H1.2則不能結(jié)合（Fig.5d-g）；并且兩種突變都會(huì)導(dǎo)致H1.2不能在DNA損傷時(shí)解離（Fig.5h）。

Figure 5

6：H1.2的PAR修飾對(duì)DNA損傷后ATM激活至關(guān)重要

細(xì)胞中Parp的缺失和抑制劑都能減少ATM激活（Fig.6a-c）；然而如果進(jìn)一步降低H1.2水平，這種ATM的功能抑制又會(huì)被恢復(fù)（Fig.6d）。過(guò)表達(dá)突變型的H1.2 S188A抑制ATM的激活（Fig.6e-f）；PAR修飾的H1.2與MRE11的結(jié)合能力減弱，導(dǎo)致其抑制ATM激活的能力相應(yīng)減弱（Fig.6g-i）。

Figure 6

7：H1.2的解離和降解對(duì)DNA修復(fù)以及細(xì)胞生存至關(guān)重要

首先研究者發(fā)現(xiàn)，H1.2敲除后的細(xì)胞，在DNA損傷后存活能力更強(qiáng)（Fig.7a-b）,HR和NHEJ兩種DNA修復(fù)水平都會(huì)升高（Fig.7c-d）。ATM敲除細(xì)胞的修復(fù)能力則會(huì)下降，且不能被H1.2敲除恢復(fù)（Fig.7e-f）。H1.2敲除細(xì)胞增強(qiáng)的修復(fù)能力，會(huì)被H1.2 S188A的過(guò)表達(dá)破壞（Fig.7g-h），證明H1.2的PAR修飾對(duì)這一過(guò)程至關(guān)重要。

Figure 7

本研究詳細(xì)分析了前人已經(jīng)觀察到的H1尤其是H1.2對(duì)于DNA損傷修復(fù)過(guò)程的作用，解析了其分子機(jī)制：

H1.2結(jié)合于染色體上，在DNA損傷后被PAR修飾、從而降解，引起ATM的激活，與MRN復(fù)合體一起作用于DNA損傷修復(fù)。

1. Zhiming Li, et al. Destabilization of linker histone H1.2 is essential for ATM activation and DNA damage repair. Cell Research (2018).

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