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細胞培養(yǎng)是雜交瘤制備單克隆抗體過程中必不可少的實驗操作，細胞培養(yǎng)是一個困難重重的事情，多少英雄都在細胞培養(yǎng)上自掛東南枝，本文就細胞培養(yǎng)的步驟及注意事項做一描述。 步驟一、復(fù)蘇1. 把凍存管從液氮中取出來，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動。液體都融化后（大概1-1.5分鐘），拿出來噴點酒精放到超凈工作臺里。 2. 把上述細胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來），1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。 3. 把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細胞懸浮起來。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)皿中的細胞均勻分布。 4. 標(biāo)好細胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后換培養(yǎng)基。 5. 3天換一次培養(yǎng)基。 二、傳代1. 培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時要傳代。 2. 把原有培養(yǎng)基吸掉。 3. 加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細胞就行），消化1-2分鐘。 4. 細胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化。 5. 用移液槍吹打細胞，把細胞都懸浮起來。 6. 把細胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。 7. 倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細胞都吹起來。 8. 根據(jù)細胞種類把細胞傳到幾個培養(yǎng)皿中。一般，癌細胞分5個，正常細胞傳3個。繼續(xù)培養(yǎng)。 三、 凍存把細胞消化下來并離心（同上）。用配好的凍存液把細胞懸浮起來，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細胞種類，凍存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃過夜，然后放到液氮灌中保存。 凍存液的配制： 70%的完全培養(yǎng)基+20?S+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。 注意事項嚴(yán)格無菌操作，多噴噴酒精，要是對滅菌的東西不放心，自己包自己送自己烘干。 不要和別人共用試劑耗材，自己準(zhǔn)備一套。有可能的話在拿到新細胞的時候做好支原體衣原體檢測。 水浴鍋很臟，生化培養(yǎng)箱要是得手動加濕的話盤里的水也會很臟，勤換 (滅菌水加進去)。 晚上離開的時候最好給細胞房照紫外，超凈臺是用完就開。 最好的是同一時間就你一個人在用細胞房在養(yǎng)細胞。 別怕浪費。槍頭什么的只要有可能污染就換，如果用酒精燈就什么都稍微烤一下，別直接放到火上，離一段距離。動作要既輕柔又有力。動作太重會有一堆一堆的氣泡，動作太輕就吹不下來... 剛開始的時候吹細胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后來就是吹的時候槍里的培養(yǎng)基不要一次全都壓出來，留一點，槍的最頭部盡量深的在液面以下。 離開過操作臺的東西再進操作臺之前一定要用酒精噴一遍，包括一切實驗耗材、儀器、以及你帶著手套的手。 實驗結(jié)束后對實驗臺的消毒。紫外什么的，用前用后都照個 30 分鐘。 身體的各個部分盡量的少接觸不需要接觸的地方的地方。比如實驗臺，又比如培養(yǎng)箱內(nèi)部。 細胞的密度根據(jù)細胞的性質(zhì)、傳代的時間以及自己的心情來定。培養(yǎng)基的話最多最多不要超過 2 天就要換一次。細胞可以不傳代，但是培養(yǎng)基是一定要換的。 大概就是，不該碰的地方不碰，有影響的地方少碰; 該使勁的時候絕對不含糊，不該使勁的地方一定忍住。如果是比較簡陋的操作臺就一定要擺個酒精燈，所有操作緊密圍繞在酒精燈周圍進行。如果是高級臺子就多用酒精噴噴。感覺生物的實驗，心疼錢就還是不要做了。 最后一點點絕對非科班的經(jīng)驗。癌細胞真是堅挺。有一次實在是不想傳了，放了 5 天吧，感覺都長了幾層出來，培養(yǎng)基都黃了。抱著試一試的心情傳了一次，又堅強的活過來了。當(dāng)然，狀態(tài)肯定也差的很了。培養(yǎng)細胞前，可以看看細胞特點說明書，包括細胞正常生長的狀態(tài)圖、傳代、培養(yǎng)基的類型等。 不同細胞生長周期不同，有的生長很快，比如說 MDA-MB-231，傳代的時候取離心懸液的十分之一就已經(jīng)足夠了，有的又是特別慢，等的人心焦，BT474 就是，傳代是一分二，復(fù)蘇起始的時候兩周多才能長滿，所以就要在培養(yǎng)細胞的過程中多多摸索了。 對于嬌弱的細胞，就得細心呵護了，胰酶消化不能過久，吹得時候要輕柔，離心時候也要注意轉(zhuǎn)速和時間，每天都要去看一下細胞，肉眼觀察培養(yǎng)基狀況、顯微鏡下觀察細胞生長狀況。 凍存細胞復(fù)蘇后第二天最好更換一次培養(yǎng)基。 培養(yǎng)箱隔一段時間徹底用酒精棉擦洗一次。 在生物安全柜 (或者超凈臺)，槍頭，血清管，血清，培養(yǎng)基，瓶子都足夠好，并且細胞房有良好的衛(wèi)生措施 (比如隔離服，手套，口罩，清潔，HEPA 等等) 且不違法操作原則的情況下，你其實很難污染。 上述條件不完備的情況下，就要多注意無菌操作了：比如要用的東西提前拿到臺子里照啊 (不過這個其實也不大好，因為會擋住紫外線)，使用前 SDS+酒精擦臺子，進出超凈臺一定要酒精擦手。 至少 1 天看 1 次。 現(xiàn)在一大型藥企養(yǎng)細胞做檢測，工作量很大，很多地方都沒辦法非常仔細的做。但是兩年下來只出現(xiàn)過一次污染，總結(jié)一下心得： 1. 好的潔凈室，空調(diào)系統(tǒng)跟得上。 2. 好的生物安全柜，硬件跟的上。 3. 瓶子移液器吸頭大都是進口，耗材跟的上。除了這些就是自己的操作習(xí)慣了。 4. 任何東西不要從敞開的瓶口上面經(jīng)過。 5. 雖然酒精燈會干擾安全柜氣流但是還是需要一盞用來勤燒瓶口。 6. 實驗時所用材料的位置擺放要順手，污染源和已滅菌物品要分開放置。養(yǎng)細胞就像打仗 細胞飼養(yǎng)涵蓋的內(nèi)容太廣了，而且不同種類細胞的飼養(yǎng)難度以及技術(shù)要求不同，腫瘤細胞，成纖維細胞，上皮細胞... 甚至各類干細胞... 每一種都有自己的生長要求。如果只是單純的一般性操作，大同小異，個人覺得練好技術(shù)的情況下注意幾點就好: 1. 各種無菌，從培養(yǎng)基到操作過程再到培養(yǎng)箱，時刻注意無菌。本人曾經(jīng)所在的實驗室出現(xiàn)過大規(guī)模污染并最終導(dǎo)致所有細胞集體毀滅... 教訓(xùn)慘痛。 2. 培養(yǎng)基的配制一定要做好梯度摸索并詳細記錄，否則細胞死都不知道怎么死的。 3. 盡量提高操作熟練度，減少培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱外的滯留時間，細胞很脆弱，經(jīng)不起折騰，不像人，熱了有空調(diào)，冷了能烤火。 4. 把握好培養(yǎng)基更換的時間，不同細胞類型時間不同，早了浪費試劑，晚了可能全軍覆沒。 5. 經(jīng)驗很重要，養(yǎng)細胞的很多經(jīng)驗?zāi)闶菬o法在公開的書籍和資料上找到的。多向?qū)嶒炇仪拜厡W(xué)習(xí)，他們會讓你少走很多彎路，真的。 養(yǎng)細胞就像打仗，知彼知己，百戰(zhàn)不殆。只有了解你養(yǎng)的對象，才能把他養(yǎng)好。 |
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